(cid:35)(cid:83)(cid:74)(cid:70)(cid:71)(cid:1)(cid:83)(cid:70)(cid:81)(cid:80)(cid:83)(cid:85)
`
`(cid:36)(cid:37)(cid:19)(cid:25)(cid:1)(cid:68)(cid:80)(cid:84)(cid:85)(cid:74)(cid:78)(cid:86)(cid:77)(cid:66)(cid:85)(cid:74)(cid:80)(cid:79)(cid:1)(cid:74)(cid:78)(cid:81)(cid:83)(cid:80)(cid:87)(cid:70)(cid:84)(cid:1)(cid:70)(cid:89)(cid:81)(cid:66)(cid:79)(cid:84)(cid:74)(cid:80)(cid:79)(cid:1)(cid:66)(cid:79)(cid:69)(cid:1)
`(cid:81)(cid:70)(cid:83)(cid:84)(cid:74)(cid:84)(cid:85)(cid:70)(cid:79)(cid:68)(cid:70)(cid:1)(cid:80)(cid:71)(cid:1)(cid:68)(cid:73)(cid:74)(cid:78)(cid:70)(cid:83)(cid:74)(cid:68)(cid:1)(cid:66)(cid:79)(cid:85)(cid:74)(cid:72)(cid:70)(cid:79)(cid:1)(cid:83)(cid:70)(cid:68)(cid:70)(cid:81)(cid:85)(cid:80)(cid:83)(cid:109)
`(cid:78)(cid:80)(cid:69)(cid:74)(cid:71)(cid:74)(cid:70)(cid:69)(cid:1)(cid:53)(cid:1)(cid:68)(cid:70)(cid:77)(cid:77)(cid:84)(cid:1)(cid:74)(cid:79)(cid:1)(cid:77)(cid:90)(cid:78)(cid:81)(cid:73)(cid:80)(cid:78)(cid:66)(cid:1)(cid:81)(cid:66)(cid:85)(cid:74)(cid:70)(cid:79)(cid:85)(cid:84)
`
`Barbara Savoldo,1,2 Carlos Almeida Ramos,1,3,4 Enli Liu,1 Martha P. Mims,3
`Michael J. Keating,5 George Carrum,1,4 Rammurti T. Kamble,1,4 Catherine M. Bollard,1,3,4
`Adrian P. Gee,1 Zhuyong Mei,1 Hao Liu,6 Bambi Grilley,1,2 Cliona M. Rooney,1,2,7,8
`Helen E. Heslop,1,2,3,4 Malcolm K. Brenner,1,2,3,4 and Gianpietro Dotti1,3,8
`
`1Center for Cell and Gene Therapy, Baylor College of Medicine, Houston, Texas, USA. 2Department of Pediatrics, Texas Children’s Hospital,
`Houston, Texas, USA. 3Department of Medicine, Baylor College of Medicine, Houston, Texas, USA. 4The Methodist Hospital, Houston, Texas, USA.
`5The University of Texas MD Anderson Cancer Center, Houston, Texas, USA. 6Biostatistics Core of the Dan L. Duncan Cancer Center,
`Houston, Texas, USA. 7Department of Virology and 8Department of Immunology, Baylor College of Medicine, Houston, Texas, USA.
`
`Targeted T cell immunotherapies using engineered T lymphocytes expressing tumor-directed chimeric anti-
`gen receptors (CARs) are designed to benefit patients with cancer. Although incorporation of costimula-
`tory endodomains within these CARs increases the proliferation of CAR-redirected T lymphocytes, it has
`proven difficult to draw definitive conclusions about the specific effects of costimulatory endodomains on
`the expansion, persistence, and antitumor effectiveness of CAR-redirected T cells in human subjects, owing
`to the lack of side-by-side comparisons with T cells bearing only a single signaling domain. We therefore
`designed a study that allowed us to directly measure the consequences of adding a costimulatory endodomain
`to CAR-redirected T cells. Patients with B cell lymphomas were simultaneously infused with 2 autologous T
`cell products expressing CARs with the same specificity for the CD19 antigen, present on most B cell malig-
`nancies. One CAR encoded both the costimulatory CD28 and the ζ-endodomains, while the other encoded
`only the ζ-endodomain. CAR+ T cells containing the CD28 endodomain showed strikingly enhanced expan-
`sion and persistence compared with CAR+ T cells lacking this endodomain. These results demonstrate the
`superiority of CARs with dual signal domains and confirm a method of comparing CAR-modified T cells
`within individual patients, thereby avoiding patient-to-patient variability and accelerating the development
`of optimal T cell immunotherapies.
`
`(cid:42)(cid:79)(cid:85)(cid:83)(cid:80)(cid:69)(cid:86)(cid:68)(cid:85)(cid:74)(cid:80)(cid:79)
`As T cell immunotherapy extends into clinical application (1, 2),
`its benefits are being expanded by engineering T lymphocytes
`to express chimeric antigen receptors (CARs) that recognize
`specific antigens expressed on the cell surface of different
`types of tumor cells (3–8). CAR molecules usually combine the
`antigen-binding domain of the variable regions of a specific
`monoclonal antibody (scFv) with the CD3ζ endodomain of the
`TCR/CD3 complex (so-called first-generation CARs) (4). When
`expressed by T lymphocytes, CARs provide potent antigen-spe-
`cific, non-MHC-restricted effector function against tumor cells
`in preclinical models (5). However, in the initial human trials, T
`lymphocytes expressing first-generation CARs showed limited
`expansion and relatively short persistence (3, 9, 10). This result
`likely reflects the failure of artificial CAR molecules to fully acti-
`vate T cells after antigen engagement on tumor cells, especially
`when the tumor cells lack expression of costimulatory molecules
`(such as CD80 and CD86) that are required for sustained T cell
`activation, growth, and survival (11).
`To provide the costimulation lacking in tumor cell targets and
`thereby overcome the above limitations, several groups have incor-
`porated costimulatory endodomains, including CD28 (12), 4-1BB
`(13, 14), or OX40 (15), into CAR molecules (so-called second-
`
`Conflict of interest: The authors have declared that no conflict of interest exists.
`Citation for this article: J Clin Invest. 2011;121(5):1822–1826. doi:10.1172/JCI46110.
`
`generation CARs). Although preclinical studies suggest that this
`strategy can indeed augment the activation of CAR-modified T
`lymphocytes (5, 7, 12), there has been no direct demonstration of
`this effect in human subjects. To meet this challenge, we designed
`a clinical study in which patients with non-Hodgkin lymphomas
`(NHLs) were infused simultaneously with 2 autologous T cell prod-
`ucts, each containing cells that expressed an identical CAR exodo-
`main specific for the CD19 antigen (CD19-specific scFv) (16–18).
`In one product the CAR was coupled to the ζ-endodomain alone
`(CAR.CD19ζ), while in the second product the CAR was coupled
`to both the CD28 and ζ-endodomains (CAR.CD19-28ζ). With this
`study design, each patient acted as a “self-control,” allowing us to
`directly determine in vivo the effects of incorporating a costimula-
`tory endodomain on the fate of the CAR-engineered T cells.
`
`(cid:51)(cid:70)(cid:84)(cid:86)(cid:77)(cid:85)(cid:84)(cid:1)(cid:66)(cid:79)(cid:69)(cid:1)(cid:37)(cid:74)(cid:84)(cid:68)(cid:86)(cid:84)(cid:84)(cid:74)(cid:80)(cid:79)
`We enrolled 6 patients, aged 46 to 59 years, with relapsed or refrac-
`tory NHL (Supplemental Table 1; supplemental material available
`online with this article; doi:10.1172/JCI46110DS1). Each patient
`had active disease, measurable by physical examination or CT or
`PET imaging at the time of the T cell infusions. We generated 2 CAR-
`transduced T cell products for each patient, always from the same
`blood collection. Polyclonal T cell lines were generated after a period
`of culture (mean, 13 days; range, 6–18 days). Products that expressed
`either CAR.CD19ζ or CAR.CD19-28ζ transgenes were similar by
`functional and phenotypic analyses (Figure 1). Two patients were
`
`(cid:18)(cid:25)(cid:19)(cid:19)
`
`The Journal of Clinical Investigation http://www.jci.org Volume 121 Number 5 May 2011
`
`UPenn Ex. 2010
`Miltenyi v. UPenn
`IPR2022-00855
`
`
`
`(cid:36)(cid:37)(cid:19)(cid:25)(cid:1)(cid:68)(cid:80)(cid:84)(cid:85)(cid:74)(cid:78)(cid:86)(cid:77)(cid:66)(cid:85)(cid:74)(cid:80)(cid:79)(cid:1)(cid:74)(cid:78)(cid:81)(cid:83)(cid:80)(cid:87)(cid:70)(cid:84)(cid:1)(cid:70)(cid:89)(cid:81)(cid:66)(cid:79)(cid:84)(cid:74)(cid:80)(cid:79)(cid:1)(cid:66)(cid:79)(cid:69)(cid:1)
`(cid:81)(cid:70)(cid:83)(cid:84)(cid:74)(cid:84)(cid:85)(cid:70)(cid:79)(cid:68)(cid:70)(cid:1)(cid:80)(cid:71)(cid:1)(cid:68)(cid:73)(cid:74)(cid:78)(cid:70)(cid:83)(cid:74)(cid:68)(cid:1)(cid:66)(cid:79)(cid:85)(cid:74)(cid:72)(cid:70)(cid:79)(cid:1)(cid:83)(cid:70)(cid:68)(cid:70)(cid:81)(cid:85)(cid:80)(cid:83)(cid:109)
`(cid:78)(cid:80)(cid:69)(cid:74)(cid:71)(cid:74)(cid:70)(cid:69)(cid:1)(cid:53)(cid:1)(cid:68)(cid:70)(cid:77)(cid:77)(cid:84)(cid:1)(cid:74)(cid:79)(cid:1)(cid:77)(cid:90)(cid:78)(cid:81)(cid:73)(cid:80)(cid:78)(cid:66)(cid:1)(cid:81)(cid:66)(cid:85)(cid:74)(cid:70)(cid:79)(cid:85)(cid:84)
`
`Barbara Savoldo,1,2 Carlos Almeida Ramos,1,3,4 Enli Liu,1 Martha P. Mims,3
`Michael J. Keating,5 George Carrum,1,4 Rammurti T. Kamble,1,4 Catherine M. Bollard,1,3,4
`Adrian P. Gee,1 Zhuyong Mei,1 Hao Liu,6 Bambi Grilley,1,2 Cliona M. Rooney,1,2,7,8
`Helen E. Heslop,1,2,3,4 Malcolm K. Brenner,1,2,3,4 and Gianpietro Dotti1,3,8
`
`1Center for Cell and Gene Therapy, Baylor College of Medicine, Houston, Texas, USA. 2Department of Pediatrics, Texas Children’s Hospital,
`Houston, Texas, USA. 3Department of Medicine, Baylor College of Medicine, Houston, Texas, USA. 4The Methodist Hospital, Houston, Texas, USA.
`5The University of Texas MD Anderson Cancer Center, Houston, Texas, USA. 6Biostatistics Core of the Dan L. Duncan Cancer Center,
`Houston, Texas, USA. 7Department of Virology and 8Department of Immunology, Baylor College of Medicine, Houston, Texas, USA.
`
`Targeted T cell immunotherapies using engineered T lymphocytes expressing tumor-directed chimeric anti-
`gen receptors (CARs) are designed to benefit patients with cancer. Although incorporation of costimula-
`tory endodomains within these CARs increases the proliferation of CAR-redirected T lymphocytes, it has
`proven difficult to draw definitive conclusions about the specific effects of costimulatory endodomains on
`the expansion, persistence, and antitumor effectiveness of CAR-redirected T cells in human subjects, owing
`to the lack of side-by-side comparisons with T cells bearing only a single signaling domain. We therefore
`designed a study that allowed us to directly measure the consequences of adding a costimulatory endodomain
`to CAR-redirected T cells. Patients with B cell lymphomas were simultaneously infused with 2 autologous T
`cell products expressing CARs with the same specificity for the CD19 antigen, present on most B cell malig-
`nancies. One CAR encoded both the costimulatory CD28 and the ζ-endodomains, while the other encoded
`only the ζ-endodomain. CAR+ T cells containing the CD28 endodomain showed strikingly enhanced expan-
`sion and persistence compared with CAR+ T cells lacking this endodomain. These results demonstrate the
`superiority of CARs with dual signal domains and confirm a method of comparing CAR-modified T cells
`within individual patients, thereby avoiding patient-to-patient variability and accelerating the development
`of optimal T cell immunotherapies.
`
`(cid:42)(cid:79)(cid:85)(cid:83)(cid:80)(cid:69)(cid:86)(cid:68)(cid:85)(cid:74)(cid:80)(cid:79)
`As T cell immunotherapy extends into clinical application (1, 2),
`its benefits are being expanded by engineering T lymphocytes
`to express chimeric antigen receptors (CARs) that recognize
`specific antigens expressed on the cell surface of different
`types of tumor cells (3–8). CAR molecules usually combine the
`antigen-binding domain of the variable regions of a specific
`monoclonal antibody (scFv) with the CD3ζ endodomain of the
`TCR/CD3 complex (so-called first-generation CARs) (4). When
`expressed by T lymphocytes, CARs provide potent antigen-spe-
`cific, non-MHC-restricted effector function against tumor cells
`in preclinical models (5). However, in the initial human trials, T
`lymphocytes expressing first-generation CARs showed limited
`expansion and relatively short persistence (3, 9, 10). This result
`likely reflects the failure of artificial CAR molecules to fully acti-
`vate T cells after antigen engagement on tumor cells, especially
`when the tumor cells lack expression of costimulatory molecules
`(such as CD80 and CD86) that are required for sustained T cell
`activation, growth, and survival (11).
`To provide the costimulation lacking in tumor cell targets and
`thereby overcome the above limitations, several groups have incor-
`porated costimulatory endodomains, including CD28 (12), 4-1BB
`(13, 14), or OX40 (15), into CAR molecules (so-called second-
`
`Conflict of interest: The authors have declared that no conflict of interest exists.
`Citation for this article: J Clin Invest. 2011;121(5):1822–1826. doi:10.1172/JCI46110.
`
`generation CARs). Although preclinical studies suggest that this
`strategy can indeed augment the activation of CAR-modified T
`lymphocytes (5, 7, 12), there has been no direct demonstration of
`this effect in human subjects. To meet this challenge, we designed
`a clinical study in which patients with non-Hodgkin lymphomas
`(NHLs) were infused simultaneously with 2 autologous T cell prod-
`ucts, each containing cells that expressed an identical CAR exodo-
`main specific for the CD19 antigen (CD19-specific scFv) (16–18).
`In one product the CAR was coupled to the ζ-endodomain alone
`(CAR.CD19ζ), while in the second product the CAR was coupled
`to both the CD28 and ζ-endodomains (CAR.CD19-28ζ). With this
`study design, each patient acted as a “self-control,” allowing us to
`directly determine in vivo the effects of incorporating a costimula-
`tory endodomain on the fate of the CAR-engineered T cells.
`
`(cid:51)(cid:70)(cid:84)(cid:86)(cid:77)(cid:85)(cid:84)(cid:1)(cid:66)(cid:79)(cid:69)(cid:1)(cid:37)(cid:74)(cid:84)(cid:68)(cid:86)(cid:84)(cid:84)(cid:74)(cid:80)(cid:79)
`We enrolled 6 patients, aged 46 to 59 years, with relapsed or refrac-
`tory NHL (Supplemental Table 1; supplemental material available
`online with this article; doi:10.1172/JCI46110DS1). Each patient
`had active disease, measurable by physical examination or CT or
`PET imaging at the time of the T cell infusions. We generated 2 CAR-
`transduced T cell products for each patient, always from the same
`blood collection. Polyclonal T cell lines were generated after a period
`of culture (mean, 13 days; range, 6–18 days). Products that expressed
`either CAR.CD19ζ or CAR.CD19-28ζ transgenes were similar by
`functional and phenotypic analyses (Figure 1). Two patients were
`
`(cid:18)(cid:25)(cid:19)(cid:19)
`
`The Journal of Clinical Investigation http://www.jci.org Volume 121 Number 5 May 2011
`
`UPenn Ex. 2010
`Miltenyi v. UPenn
`IPR2022-00855
`
`
`
`(cid:67)(cid:83)(cid:74)(cid:70)(cid:71)(cid:1)(cid:83)(cid:70)(cid:81)(cid:80)(cid:83)(cid:85)
`
`(cid:39)(cid:74)(cid:72)(cid:86)(cid:83)(cid:70)(cid:1)(cid:18)
`(cid:53)(cid:83)(cid:66)(cid:79)(cid:84)(cid:69)(cid:86)(cid:68)(cid:85)(cid:74)(cid:80)(cid:79)(cid:1)(cid:70)(cid:71)(cid:71)(cid:74)(cid:68)(cid:74)(cid:70)(cid:79)(cid:68)(cid:90)(cid:1)(cid:66)(cid:79)(cid:69)(cid:1)(cid:81)(cid:73)(cid:70)(cid:79)(cid:80)(cid:85)(cid:90)(cid:81)(cid:74)(cid:68)(cid:16)(cid:71)(cid:86)(cid:79)(cid:68)(cid:85)(cid:74)(cid:80)(cid:79)(cid:1)(cid:81)(cid:83)(cid:80)(cid:71)(cid:74)(cid:77)(cid:70)(cid:1)(cid:80)(cid:71)(cid:1)(cid:53)(cid:1)(cid:68)(cid:70)(cid:77)(cid:77)(cid:1)(cid:77)(cid:74)(cid:79)(cid:70)(cid:84)(cid:15)(cid:1)(cid:9)(cid:34)(cid:10)(cid:1)(cid:39)(cid:34)(cid:36)(cid:52)(cid:1)(cid:66)(cid:79)(cid:69)(cid:1)(cid:50)(cid:14)(cid:49)(cid:36)(cid:51)(cid:1)(cid:66)(cid:79)(cid:66)(cid:77)(cid:90)(cid:84)(cid:70)(cid:84)(cid:1)(cid:84)(cid:73)(cid:80)(cid:88)(cid:74)(cid:79)(cid:72)(cid:1)(cid:85)(cid:83)(cid:66)(cid:79)(cid:84)(cid:69)(cid:86)(cid:68)(cid:85)(cid:74)(cid:80)(cid:79)(cid:1)(cid:70)(cid:71)(cid:71)(cid:74)(cid:68)(cid:74)(cid:70)(cid:79)(cid:68)(cid:90)(cid:1)(cid:88)(cid:74)(cid:85)(cid:73)(cid:1)(cid:36)(cid:34)(cid:51)(cid:15)
`(cid:36)(cid:37)(cid:18)(cid:26)ζ(cid:1)(cid:66)(cid:79)(cid:69)(cid:1)(cid:36)(cid:34)(cid:51)(cid:15)(cid:36)(cid:37)(cid:18)(cid:26)(cid:14)(cid:19)(cid:25)ζ(cid:1)(cid:87)(cid:70)(cid:68)(cid:85)(cid:80)(cid:83)(cid:84)(cid:1)(cid:9)(cid:77)(cid:70)(cid:71)(cid:85)(cid:10)(cid:15)(cid:1)(cid:35)(cid:66)(cid:83)(cid:84)(cid:1)(cid:74)(cid:79)(cid:69)(cid:74)(cid:68)(cid:66)(cid:85)(cid:70)(cid:1)(cid:78)(cid:70)(cid:66)(cid:79)(cid:1)(cid:87)(cid:66)(cid:77)(cid:86)(cid:70)(cid:84)(cid:1)(cid:71)(cid:80)(cid:83)(cid:1)(cid:81)(cid:70)(cid:83)(cid:74)(cid:81)(cid:73)(cid:70)(cid:83)(cid:66)(cid:77)(cid:1)(cid:67)(cid:77)(cid:80)(cid:80)(cid:69)(cid:1)(cid:84)(cid:66)(cid:78)(cid:81)(cid:77)(cid:70)(cid:84)(cid:1)(cid:71)(cid:83)(cid:80)(cid:78)(cid:1)(cid:23)(cid:1)(cid:81)(cid:66)(cid:85)(cid:74)(cid:70)(cid:79)(cid:85)(cid:84)(cid:1)(cid:9)(cid:52)(cid:86)(cid:81)(cid:81)(cid:77)(cid:70)(cid:78)(cid:70)(cid:79)(cid:85)(cid:66)(cid:77)(cid:1)(cid:53)(cid:66)(cid:67)(cid:77)(cid:70)(cid:1)(cid:18)(cid:10)(cid:15)(cid:1)(cid:38)(cid:66)(cid:68)(cid:73)(cid:1)
`(cid:84)(cid:90)(cid:78)(cid:67)(cid:80)(cid:77)(cid:1)(cid:83)(cid:70)(cid:81)(cid:83)(cid:70)(cid:84)(cid:70)(cid:79)(cid:85)(cid:84)(cid:1)(cid:66)(cid:79)(cid:1)(cid:74)(cid:79)(cid:69)(cid:74)(cid:87)(cid:74)(cid:69)(cid:86)(cid:66)(cid:77)(cid:1)(cid:68)(cid:70)(cid:77)(cid:77)(cid:1)(cid:77)(cid:74)(cid:79)(cid:70)(cid:15)(cid:1)(cid:51)(cid:70)(cid:81)(cid:83)(cid:70)(cid:84)(cid:70)(cid:79)(cid:85)(cid:66)(cid:85)(cid:74)(cid:87)(cid:70)(cid:1)(cid:73)(cid:74)(cid:84)(cid:85)(cid:80)(cid:72)(cid:83)(cid:66)(cid:78)(cid:84)(cid:1)(cid:80)(cid:71)(cid:1)(cid:53)(cid:1)(cid:68)(cid:70)(cid:77)(cid:77)(cid:84)(cid:1)(cid:85)(cid:83)(cid:66)(cid:79)(cid:84)(cid:69)(cid:86)(cid:68)(cid:70)(cid:69)(cid:1)(cid:88)(cid:74)(cid:85)(cid:73)(cid:1)(cid:36)(cid:34)(cid:51)(cid:15)(cid:36)(cid:37)(cid:18)(cid:26)ζ(cid:1)(cid:66)(cid:79)(cid:69)(cid:1)(cid:36)(cid:34)(cid:51)(cid:15)(cid:36)(cid:37)(cid:18)(cid:26)(cid:14)(cid:19)(cid:25)ζ(cid:1)(cid:87)(cid:70)(cid:68)(cid:85)(cid:80)(cid:83)(cid:84)(cid:1)(cid:71)(cid:83)(cid:80)(cid:78)(cid:1)
`(cid:81)(cid:66)(cid:85)(cid:74)(cid:70)(cid:79)(cid:85)(cid:84)(cid:1)(cid:79)(cid:86)(cid:78)(cid:67)(cid:70)(cid:83)(cid:1)(cid:18)(cid:1)(cid:66)(cid:79)(cid:69)(cid:1)(cid:79)(cid:86)(cid:78)(cid:67)(cid:70)(cid:83)(cid:1)(cid:22)(cid:1)(cid:66)(cid:83)(cid:70)(cid:1)(cid:66)(cid:77)(cid:84)(cid:80)(cid:1)(cid:81)(cid:83)(cid:70)(cid:84)(cid:70)(cid:79)(cid:85)(cid:70)(cid:69)(cid:1)(cid:9)(cid:83)(cid:74)(cid:72)(cid:73)(cid:85)(cid:10)(cid:15)(cid:1)(cid:47)(cid:86)(cid:78)(cid:67)(cid:70)(cid:83)(cid:84)(cid:1)(cid:83)(cid:70)(cid:81)(cid:83)(cid:70)(cid:84)(cid:70)(cid:79)(cid:85)(cid:1)(cid:85)(cid:73)(cid:70)(cid:1)(cid:81)(cid:70)(cid:83)(cid:68)(cid:70)(cid:79)(cid:85)(cid:66)(cid:72)(cid:70)(cid:1)(cid:80)(cid:71)(cid:1)(cid:36)(cid:34)(cid:51)(cid:12)(cid:1)(cid:68)(cid:70)(cid:77)(cid:77)(cid:84)(cid:15)(cid:1)(cid:9)(cid:35)(cid:10)(cid:1)(cid:51)(cid:70)(cid:84)(cid:86)(cid:77)(cid:85)(cid:84)(cid:1)(cid:80)(cid:71)(cid:1)(cid:66)(cid:1)(cid:21)(cid:14)(cid:73)(cid:80)(cid:86)(cid:83)(cid:1)(cid:22)(cid:18)(cid:36)(cid:83)(cid:14)
`(cid:83)(cid:70)(cid:77)(cid:70)(cid:66)(cid:84)(cid:70)(cid:1)(cid:66)(cid:84)(cid:84)(cid:66)(cid:90)(cid:1)(cid:66)(cid:85)(cid:1)(cid:66)(cid:79)(cid:1)(cid:70)(cid:71)(cid:71)(cid:70)(cid:68)(cid:85)(cid:80)(cid:83)(cid:16)(cid:85)(cid:86)(cid:78)(cid:80)(cid:83)(cid:1)(cid:68)(cid:70)(cid:77)(cid:77)(cid:1)(cid:9)(cid:38)(cid:16)(cid:53)(cid:10)(cid:1)(cid:83)(cid:66)(cid:85)(cid:74)(cid:80)(cid:1)(cid:80)(cid:71)(cid:1)(cid:19)(cid:17)(cid:27)(cid:18)(cid:15)(cid:1)(cid:53)(cid:66)(cid:83)(cid:72)(cid:70)(cid:85)(cid:1)(cid:68)(cid:70)(cid:77)(cid:77)(cid:84)(cid:1)(cid:88)(cid:70)(cid:83)(cid:70)(cid:1)(cid:51)(cid:66)(cid:75)(cid:74)(cid:1)(cid:9)(cid:36)(cid:37)(cid:18)(cid:26)(cid:12)(cid:13)(cid:1)(cid:36)(cid:37)(cid:25)(cid:17)(cid:12)(cid:13)(cid:1)(cid:36)(cid:37)(cid:25)(cid:23)(cid:109)(cid:10)(cid:13)(cid:1)(cid:66)(cid:1)(cid:35)(cid:86)(cid:83)(cid:76)(cid:74)(cid:85)(cid:85)(cid:1)(cid:77)(cid:90)(cid:78)(cid:81)(cid:73)(cid:80)(cid:78)(cid:66)(cid:1)(cid:68)(cid:70)(cid:77)(cid:77)(cid:1)(cid:77)(cid:74)(cid:79)(cid:70)(cid:28)(cid:1)(cid:41)(cid:45)(cid:37)(cid:46)(cid:14)(cid:19)(cid:1)
`(cid:9)(cid:36)(cid:37)(cid:18)(cid:26)(cid:109)(cid:13)(cid:1)(cid:36)(cid:37)(cid:25)(cid:17)(cid:12)(cid:13)(cid:1)(cid:36)(cid:37)(cid:25)(cid:23)(cid:12)(cid:10)(cid:13)(cid:1)(cid:66)(cid:1)(cid:41)(cid:80)(cid:69)(cid:72)(cid:76)(cid:74)(cid:79)(cid:1)(cid:77)(cid:90)(cid:78)(cid:81)(cid:73)(cid:80)(cid:78)(cid:66)(cid:1)(cid:68)(cid:70)(cid:77)(cid:77)(cid:1)(cid:77)(cid:74)(cid:79)(cid:70)(cid:28)(cid:1)(cid:66)(cid:79)(cid:69)(cid:1)(cid:44)(cid:22)(cid:23)(cid:19)(cid:1)(cid:9)(cid:36)(cid:37)(cid:18)(cid:26)(cid:109)(cid:13)(cid:1)(cid:36)(cid:37)(cid:25)(cid:17)(cid:109)(cid:13)(cid:1)(cid:36)(cid:37)(cid:25)(cid:23)(cid:109)(cid:10)(cid:13)(cid:1)(cid:66)(cid:79)(cid:1)(cid:70)(cid:83)(cid:90)(cid:85)(cid:73)(cid:83)(cid:80)(cid:74)(cid:69)(cid:1)(cid:77)(cid:70)(cid:86)(cid:76)(cid:70)(cid:78)(cid:74)(cid:66)(cid:1)(cid:68)(cid:70)(cid:77)(cid:77)(cid:1)(cid:77)(cid:74)(cid:79)(cid:70)(cid:1)(cid:85)(cid:73)(cid:66)(cid:85)(cid:1)(cid:74)(cid:84)(cid:1)(cid:84)(cid:86)(cid:84)(cid:68)(cid:70)(cid:81)(cid:85)(cid:74)(cid:67)(cid:77)(cid:70)(cid:1)(cid:85)(cid:80)(cid:1)
`(cid:79)(cid:66)(cid:85)(cid:86)(cid:83)(cid:66)(cid:77)(cid:1)(cid:76)(cid:74)(cid:77)(cid:77)(cid:70)(cid:83)(cid:1)(cid:68)(cid:70)(cid:77)(cid:77)(cid:1)(cid:66)(cid:68)(cid:85)(cid:74)(cid:87)(cid:74)(cid:85)(cid:90)(cid:15)(cid:1)(cid:35)(cid:80)(cid:85)(cid:73)(cid:1)(cid:36)(cid:34)(cid:51)(cid:15)(cid:36)(cid:37)(cid:18)(cid:26)ζ(cid:12)(cid:1)(cid:66)(cid:79)(cid:69)(cid:1)(cid:36)(cid:34)(cid:51)(cid:15)(cid:36)(cid:37)(cid:18)(cid:26)(cid:14)(cid:19)(cid:25)ζ(cid:12)(cid:1)(cid:53)(cid:1)(cid:68)(cid:70)(cid:77)(cid:77)(cid:84)(cid:1)(cid:84)(cid:81)(cid:70)(cid:68)(cid:74)(cid:71)(cid:74)(cid:68)(cid:66)(cid:77)(cid:77)(cid:90)(cid:1)(cid:85)(cid:66)(cid:83)(cid:72)(cid:70)(cid:85)(cid:70)(cid:69)(cid:1)(cid:36)(cid:37)(cid:18)(cid:26)(cid:12)(cid:1)(cid:85)(cid:86)(cid:78)(cid:80)(cid:83)(cid:84)(cid:15)(cid:1)(cid:37)(cid:66)(cid:85)(cid:66)(cid:1)(cid:66)(cid:83)(cid:70)(cid:1)(cid:78)(cid:70)(cid:66)(cid:79)(cid:1)(cid:153)(cid:1)(cid:52)(cid:37)(cid:1)(cid:71)(cid:80)(cid:83)(cid:1)(cid:85)(cid:73)(cid:70)(cid:1)(cid:23)(cid:1)(cid:53)(cid:1)(cid:68)(cid:70)(cid:77)(cid:77)(cid:1)
`(cid:77)(cid:74)(cid:79)(cid:70)(cid:84)(cid:15)(cid:1)(cid:9)(cid:36)(cid:10)(cid:1)(cid:49)(cid:73)(cid:70)(cid:79)(cid:80)(cid:85)(cid:90)(cid:81)(cid:74)(cid:68)(cid:1)(cid:68)(cid:80)(cid:78)(cid:81)(cid:80)(cid:84)(cid:74)(cid:85)(cid:74)(cid:80)(cid:79)(cid:1)(cid:80)(cid:71)(cid:1)(cid:36)(cid:34)(cid:51)(cid:15)(cid:36)(cid:37)(cid:18)(cid:26)ζ(cid:12)(cid:1)(cid:80)(cid:83)(cid:1)(cid:36)(cid:34)(cid:51)(cid:15)(cid:36)(cid:37)(cid:18)(cid:26)(cid:14)(cid:19)(cid:25)ζ(cid:12)(cid:1)(cid:53)(cid:1)(cid:68)(cid:70)(cid:77)(cid:77)(cid:84)(cid:15)(cid:1)(cid:53)(cid:73)(cid:70)(cid:84)(cid:70)(cid:1)(cid:81)(cid:83)(cid:80)(cid:69)(cid:86)(cid:68)(cid:85)(cid:84)(cid:1)(cid:68)(cid:80)(cid:79)(cid:85)(cid:66)(cid:74)(cid:79)(cid:70)(cid:69)(cid:1)(cid:67)(cid:80)(cid:85)(cid:73)(cid:1)(cid:36)(cid:37)(cid:25)(cid:12)(cid:1)(cid:66)(cid:79)(cid:69)(cid:1)(cid:36)(cid:37)(cid:21)(cid:12)(cid:1)(cid:36)(cid:34)(cid:51)(cid:14)(cid:70)(cid:89)(cid:81)(cid:83)(cid:70)(cid:84)(cid:84)(cid:74)(cid:79)(cid:72)(cid:1)
`(cid:53)(cid:1)(cid:68)(cid:70)(cid:77)(cid:77)(cid:84)(cid:1)(cid:85)(cid:73)(cid:66)(cid:85)(cid:1)(cid:66)(cid:83)(cid:70)(cid:1)(cid:81)(cid:83)(cid:70)(cid:69)(cid:80)(cid:78)(cid:74)(cid:79)(cid:66)(cid:79)(cid:85)(cid:77)(cid:90)(cid:1)(cid:36)(cid:37)(cid:21)(cid:22)(cid:51)(cid:48)(cid:12)(cid:36)(cid:37)(cid:23)(cid:19)(cid:45)(cid:12)(cid:13)(cid:1)(cid:88)(cid:74)(cid:85)(cid:73)(cid:1)(cid:66)(cid:1)(cid:71)(cid:83)(cid:66)(cid:68)(cid:85)(cid:74)(cid:80)(cid:79)(cid:1)(cid:80)(cid:71)(cid:1)(cid:85)(cid:73)(cid:70)(cid:78)(cid:1)(cid:70)(cid:89)(cid:81)(cid:83)(cid:70)(cid:84)(cid:84)(cid:74)(cid:79)(cid:72)(cid:1)(cid:36)(cid:37)(cid:19)(cid:25)(cid:15)(cid:1)(cid:38)(cid:66)(cid:68)(cid:73)(cid:1)(cid:84)(cid:90)(cid:78)(cid:67)(cid:80)(cid:77)(cid:1)(cid:83)(cid:70)(cid:81)(cid:83)(cid:70)(cid:84)(cid:70)(cid:79)(cid:85)(cid:84)(cid:1)(cid:66)(cid:79)(cid:1)(cid:74)(cid:79)(cid:69)(cid:74)(cid:87)(cid:74)(cid:69)(cid:86)(cid:66)(cid:77)(cid:1)(cid:68)(cid:70)(cid:77)(cid:77)(cid:1)(cid:77)(cid:74)(cid:79)(cid:70)(cid:13)(cid:1)(cid:66)(cid:79)(cid:69)(cid:1)
`(cid:73)(cid:80)(cid:83)(cid:74)(cid:91)(cid:80)(cid:79)(cid:85)(cid:66)(cid:77)(cid:1)(cid:67)(cid:66)(cid:83)(cid:84)(cid:1)(cid:69)(cid:70)(cid:79)(cid:80)(cid:85)(cid:70)(cid:1)(cid:78)(cid:70)(cid:66)(cid:79)(cid:1)(cid:72)(cid:83)(cid:80)(cid:86)(cid:81)(cid:1)(cid:87)(cid:66)(cid:77)(cid:86)(cid:70)(cid:84)(cid:15)
`
`then treated with both preparations at each level of dose escalation
`(2 × 107/m2, 1 × 108/m2, or 2 × 108/m2 cells per dose). The infusions
`were well tolerated without any immediate adverse side effects.
`A pivotal question in CAR-mediated cancer immunotherapy is
`whether the introduction of dual signaling domains will enhance
`the expansion and persistence of genetically modified T cells in
`human subjects, as observed in response to tumor cells in vitro
`when these cells lack expression of costimulatory molecules (Sup-
`plemental Figure 1). We therefore assessed these end points in the
`peripheral blood of our patients by quantitative PCR (Q-PCR)
`assays specific for CAR.CD19ζ and CAR.CD19-28ζ transgenes.
`As illustrated in Figure 2, the molecular signals identifying CAR.
`CD19-28ζ+ T cells were detected at a low level as early as 3 hours
`after the first infusion (63.5 ± 15.5 copies/μg of DNA); this level
`increased to 218.2 ± 60.6 copies/μg of DNA and 1,285.8 ± 585.4 cop-
`ies/μg of DNA at 1 and 2 weeks after infusion, respectively, repre-
`senting a mean 6.82-fold change over the 3-hour value. The signals
`identifying CAR.CD19-28ζ+ T cells reached a nadir by 4 to 6 weeks
`after infusion (42.6 ± 19.5 copies/μg of DNA). Despite this decline,
`
`the remaining peripheral blood CAR.CD19-28ζ+ T cells retained
`the capacity to expand when restimulated ex vivo by engagement
`of their native TCRs (Supplemental Figure 2). Molecular signals
`derived from the CAR.CD19ζ+ T cells were also detected at 3 hours
`after infusion (41.3 ± 13.8 copies/μg of DNA), but they failed to
`expand thereafter (35.9 ± 8.2 copies/μg of DNA and 26.6 ± 7.7
`copies/μg of DNA at 1 and 2 weeks after infusion, respectively),
`becoming virtually undetectable by 6 weeks after infusion (4.3 ± 2.2
`copies/μg of DNA) (Figure 2), with only marginal reexpansion upon
`TCR stimulation in vitro (Supplemental Figure 2). By repeated
`measure ANOVA, CAR.CD19-28ζ signals were significantly higher
`than CAR.CD19ζ signals at every time point tested over the first 4
`weeks after infusion (P < 0.0001). There was no evidence of a T cell–
`dose response based on the Q-PCR assay. However, the study is not
`powered enough to detect this difference, and no definite conclu-
`sion can be drawn on this matter. Since the T cell lines we infused
`were a mixture of CAR+ CD4+ and CD8+ cells, we asked whether
`both subsets had contributed to T cell expansion in vivo. Q-PCR
`analysis of DNA extracted from FACS-sorted CD4+ and CD8+ T
`
`The Journal of Clinical Investigation http://www.jci.org Volume 121 Number 5 May 2011
`
`(cid:18)(cid:25)(cid:19)(cid:20)
`
`UPenn Ex. 2010
`Miltenyi v. UPenn
`IPR2022-00855
`
`
`
`(cid:67)(cid:83)(cid:74)(cid:70)(cid:71)(cid:1)(cid:83)(cid:70)(cid:81)(cid:80)(cid:83)(cid:85)
`
`(cid:39)(cid:74)(cid:72)(cid:86)(cid:83)(cid:70)(cid:1)(cid:19)
`(cid:42)(cid:79)(cid:1)(cid:87)(cid:74)(cid:87)(cid:80)(cid:1)(cid:70)(cid:89)(cid:81)(cid:66)(cid:79)(cid:84)(cid:74)(cid:80)(cid:79)(cid:1)(cid:66)(cid:79)(cid:69)(cid:1)(cid:81)(cid:70)(cid:83)(cid:84)(cid:74)(cid:84)(cid:85)(cid:70)(cid:79)(cid:68)(cid:70)(cid:1)(cid:80)(cid:71)(cid:1)(cid:74)(cid:79)(cid:71)(cid:86)(cid:84)(cid:70)(cid:69)(cid:1)(cid:36)(cid:34)(cid:51)(cid:15)(cid:36)(cid:37)(cid:18)(cid:26)ζ(cid:12)(cid:1)(cid:87)(cid:70)(cid:83)(cid:84)(cid:86)(cid:84)(cid:1)(cid:36)(cid:34)(cid:51)(cid:15)(cid:36)(cid:37)(cid:18)(cid:26)(cid:14)(cid:19)(cid:25)ζ(cid:12)(cid:1)(cid:53)(cid:1)(cid:68)(cid:70)(cid:77)(cid:77)(cid:1)(cid:77)(cid:74)(cid:79)(cid:70)(cid:84)(cid:1)(cid:66)(cid:84)(cid:1)(cid:66)(cid:84)(cid:84)(cid:70)(cid:84)(cid:84)(cid:70)(cid:69)(cid:1)(cid:67)(cid:90)(cid:1)(cid:50)(cid:14)(cid:49)(cid:36)(cid:51)(cid:1)(cid:74)(cid:79)(cid:1)(cid:81)(cid:70)(cid:83)(cid:74)(cid:81)(cid:73)(cid:70)(cid:83)(cid:66)(cid:77)(cid:1)(cid:67)(cid:77)(cid:80)(cid:80)(cid:69)(cid:15)(cid:1)(cid:37)(cid:66)(cid:85)(cid:66)(cid:1)
`(cid:81)(cid:80)(cid:74)(cid:79)(cid:85)(cid:84)(cid:1)(cid:83)(cid:70)(cid:81)(cid:83)(cid:70)(cid:84)(cid:70)(cid:79)(cid:85)(cid:1)(cid:68)(cid:83)(cid:74)(cid:85)(cid:74)(cid:68)(cid:66)(cid:77)(cid:1)(cid:81)(cid:80)(cid:84)(cid:85)(cid:74)(cid:79)(cid:71)(cid:86)(cid:84)(cid:74)(cid:80)(cid:79)(cid:1)(cid:74)(cid:79)(cid:85)(cid:70)(cid:83)(cid:87)(cid:66)(cid:77)(cid:84)(cid:1)(cid:66)(cid:71)(cid:85)(cid:70)(cid:83)(cid:1)(cid:85)(cid:73)(cid:70)(cid:1)(cid:71)(cid:74)(cid:83)(cid:84)(cid:85)(cid:1)(cid:80)(cid:83)(cid:1)(cid:84)(cid:70)(cid:68)(cid:80)(cid:79)(cid:69)(cid:1)(cid:74)(cid:79)(cid:71)(cid:86)(cid:84)(cid:74)(cid:80)(cid:79)(cid:1)(cid:80)(cid:71)(cid:1)(cid:78)(cid:80)(cid:69)(cid:74)(cid:71)(cid:74)(cid:70)(cid:69)(cid:1)(cid:53)(cid:1)(cid:68)(cid:70)(cid:77)(cid:77)(cid:84)(cid:15)(cid:1)(cid:49)(cid:66)(cid:85)(cid:74)(cid:70)(cid:79)(cid:85)(cid:84)(cid:1)(cid:79)(cid:86)(cid:78)(cid:67)(cid:70)(cid:83)(cid:1)(cid:18)(cid:13)(cid:1)(cid:79)(cid:86)(cid:78)(cid:67)(cid:70)(cid:83)(cid:1)(cid:20)(cid:13)(cid:1)(cid:66)(cid:79)(cid:69)(cid:1)(cid:79)(cid:86)(cid:78)(cid:67)(cid:70)(cid:83)(cid:1)(cid:22)(cid:13)(cid:1)
`(cid:88)(cid:73)(cid:80)(cid:1)(cid:73)(cid:66)(cid:69)(cid:1)(cid:84)(cid:85)(cid:66)(cid:67)(cid:77)(cid:70)(cid:1)(cid:69)(cid:74)(cid:84)(cid:70)(cid:66)(cid:84)(cid:70)(cid:1)(cid:80)(cid:83)(cid:1)(cid:68)(cid:77)(cid:74)(cid:79)(cid:74)(cid:68)(cid:66)(cid:77)(cid:1)(cid:67)(cid:70)(cid:79)(cid:70)(cid:71)(cid:74)(cid:85)(cid:1)(cid:66)(cid:85)(cid:1)(cid:23)(cid:1)(cid:88)(cid:70)(cid:70)(cid:76)(cid:84)(cid:1)(cid:66)(cid:71)(cid:85)(cid:70)(cid:83)(cid:1)(cid:85)(cid:73)(cid:70)(cid:1)(cid:71)(cid:74)(cid:83)(cid:84)(cid:85)(cid:1)(cid:53)(cid:1)(cid:68)(cid:70)(cid:77)(cid:77)(cid:1)(cid:74)(cid:79)(cid:71)(cid:86)(cid:84)(cid:74)(cid:80)(cid:79)(cid:13)(cid:1)(cid:83)(cid:70)(cid:68)(cid:70)(cid:74)(cid:87)(cid:70)(cid:69)(cid:1)(cid:66)(cid:1)(cid:84)(cid:70)(cid:68)(cid:80)(cid:79)(cid:69)(cid:1)(cid:74)(cid:79)(cid:71)(cid:86)(cid:84)(cid:74)(cid:80)(cid:79)(cid:1)(cid:80)(cid:71)(cid:1)(cid:36)(cid:34)(cid:51)(cid:14)(cid:78)(cid:80)(cid:69)(cid:74)(cid:71)(cid:74)(cid:70)(cid:69)(cid:1)(cid:53)(cid:1)(cid:77)(cid:90)(cid:78)(cid:81)(cid:73)(cid:80)(cid:68)(cid:90)(cid:85)(cid:70)(cid:84)(cid:15)(cid:1)
`(cid:49)(cid:66)(cid:85)(cid:74)(cid:70)(cid:79)(cid:85)(cid:1)(cid:79)(cid:86)(cid:78)(cid:67)(cid:70)(cid:83)(cid:1)(cid:18)(cid:1)(cid:83)(cid:70)(cid:68)(cid:70)(cid:74)(cid:87)(cid:70)(cid:69)(cid:1)(cid:80)(cid:79)(cid:77)(cid:90)(cid:1)(cid:36)(cid:34)(cid:51)(cid:15)(cid:36)(cid:37)(cid:18)(cid:26)(cid:14)(cid:19)(cid:25)ζ(cid:12)(cid:1)(cid:53)(cid:1)(cid:68)(cid:70)(cid:77)(cid:77)(cid:84)(cid:1)(cid:9)(cid:19)(cid:1)×(cid:1)(cid:18)(cid:17)(cid:24)(cid:1)(cid:68)(cid:70)(cid:77)(cid:77)(cid:84)(cid:16)(cid:78)(cid:19)(cid:13)(cid:1)(cid:85)(cid:73)(cid:70)(cid:1)(cid:84)(cid:66)(cid:78)(cid:70)(cid:1)(cid:66)(cid:84)(cid:1)(cid:71)(cid:80)(cid:83)(cid:1)(cid:85)(cid:73)(cid:70)(cid:1)(cid:71)(cid:74)(cid:83)(cid:84)(cid:85)(cid:1)(cid:74)(cid:79)(cid:71)(cid:86)(cid:84)(cid:74)(cid:80)(cid:79)(cid:10)(cid:13)(cid:1)(cid:67)(cid:70)(cid:68)(cid:66)(cid:86)(cid:84)(cid:70)(cid:1)(cid:85)(cid:73)(cid:74)(cid:84)(cid:1)(cid:88)(cid:66)(cid:84)(cid:1)(cid:85)(cid:73)(cid:70)(cid:1)(cid:80)(cid:79)(cid:77)(cid:90)(cid:1)(cid:81)(cid:83)(cid:80)(cid:69)(cid:86)(cid:68)(cid:85)(cid:1)
`(cid:66)(cid:87)(cid:66)(cid:74)(cid:77)(cid:66)(cid:67)(cid:77)(cid:70)(cid:15)(cid:1)(cid:49)(cid:66)(cid:85)(cid:74)(cid:70)(cid:79)(cid:85)(cid:1)(cid:79)(cid:86)(cid:78)(cid:67)(cid:70)(cid:83)(cid:1)(cid:20)(cid:1)(cid:83)(cid:70)(cid:68)(cid:70)(cid:74)(cid:87)(cid:70)(cid:69)(cid:1)(cid:67)(cid:80)(cid:85)(cid:73)(cid:1)(cid:36)(cid:34)(cid:51)(cid:15)(cid:36)(cid:37)(cid:18)(cid:26)(cid:14)(cid:19)(cid:25)ζ(cid:12)(cid:1)(cid:66)(cid:79)(cid:69)(cid:1)(cid:36)(cid:34)(cid:51)(cid:15)(cid:36)(cid:37)(cid:18)(cid:26)ζ(cid:12)(cid:1)(cid:53)(cid:1)(cid:68)(cid:70)(cid:77)(cid:77)(cid:84)(cid:13)(cid:1)(cid:67)(cid:86)(cid:85)(cid:1)(cid:85)(cid:73)(cid:70)(cid:1)(cid:68)(cid:70)(cid:77)(cid:77)(cid:1)(cid:69)(cid:80)(cid:84)(cid:70)(cid:1)(cid:88)(cid:66)(cid:84)(cid:1)(cid:23)(cid:17)(cid:6)(cid:1)(cid:80)(cid:71)(cid:1)(cid:85)(cid:73)(cid:70)(cid:74)(cid:83)(cid:1)(cid:71)(cid:74)(cid:83)(cid:84)(cid:85)(cid:1)(cid:69)(cid:80)(cid:84)(cid:70)(cid:1)(cid:9)(cid:18)(cid:1)×(cid:1)(cid:18)(cid:17)(cid:25)(cid:1)(cid:68)(cid:70)(cid:77)(cid:77)(cid:84)(cid:16)(cid:78)(cid:19)(cid:10)(cid:15)(cid:1)(cid:1)
`(cid:49)(cid:66)(cid:85)(cid:74)(cid:70)(cid:79)(cid:85)(cid:1)(cid:79)(cid:86)(cid:78)(cid:67)(cid:70)(cid:83)(cid:1)(cid:22)(cid:1)(cid:83)(cid:70)(cid:68)(cid:70)(cid:74)(cid:87)(cid:70)(cid:69)(cid:1)(cid:67)(cid:80)(cid:85)(cid:73)(cid:1)(cid:36)(cid:34)(cid:51)(cid:15)(cid:36)(cid:37)(cid:18)(cid:26)(cid:14)(cid:19)(cid:25)ζ(cid:12)(cid:1)(cid:66)(cid:79)(cid:69)(cid:1)(cid:36)(cid:34)(cid:51)(cid:15)(cid:36)(cid:37)(cid:18)(cid:26)ζ(cid:12)(cid:1)(cid:53)(cid:1)(cid:68)(cid:70)(cid:77)(cid:77)(cid:84)(cid:1)(cid:66)(cid:85)(cid:1)(cid:85)(cid:73)(cid:70)(cid:1)(cid:84)(cid:66)(cid:78)(cid:70)(cid:1)(cid:69)(cid:80)(cid:84)(cid:70)(cid:1)(cid:66)(cid:69)(cid:78)(cid:74)(cid:79)(cid:74)(cid:84)(cid:85)(cid:70)(cid:83)(cid:70)(cid:69)(cid:1)(cid:69)(cid:86)(cid:83)(cid:74)(cid:79)(cid:72)(cid:1)(cid:85)(cid:73)(cid:70)(cid:74)(cid:83)(cid:1)(cid:71)(cid:74)(cid:83)(cid:84)(cid:85)(cid:1)(cid:74)(cid:79)(cid:71)(cid:86)(cid:84)(cid:74)(cid:80)(cid:79)(cid:1)(cid:9)(cid:19)(cid:1)×(cid:1)(cid:18)(cid:17)(cid:25)(cid:1)
`(cid:68)(cid:70)(cid:77)(cid:77)(cid:84)(cid:16)(cid:78)(cid:19)(cid:10)(cid:15)(cid:1)(cid:48)(cid:81)(cid:70)(cid:79)(cid:1)(cid:66)(cid:83)(cid:83)(cid:80)(cid:88)(cid:84)(cid:1)(cid:74)(cid:79)(cid:69)(cid:74)(cid:68)(cid:66)(cid:85)(cid:70)(cid:1)(cid:85)(cid:73)(cid:70)(cid:1)(cid:85)(cid:74)(cid:78)(cid:70)(cid:1)(cid:80)(cid:71)(cid:1)(cid:53)(cid:1)(cid:68)(cid:70)(cid:77)(cid:77)(cid:1)(cid:74)(cid:79)(cid:71)(cid:86)(cid:84)(cid:74)(cid:80)(cid:79)(cid:13)(cid:1)(cid:66)(cid:79)(cid:69)(cid:1)(cid:69)(cid:66)(cid:84)(cid:73)(cid:70)(cid:69)(cid:1)(cid:66)(cid:83)(cid:83)(cid:80)(cid:88)(cid:84)(cid:1)(cid:74)(cid:79)(cid:69)(cid:74)(cid:68)(cid:66)(cid:85)(cid:70)(cid:1)(cid:85)(cid:73)(cid:70)(cid:1)(cid:85)(cid:74)(cid:78)(cid:70)(cid:1)(cid:88)(cid:73)(cid:70)(cid:79)(cid:1)(cid:68)(cid:73)(cid:70)(cid:78)(cid:80)(cid:85)(cid:73)(cid:70)(cid:83)(cid:66)(cid:81)(cid:90)(cid:1)(cid:88)(cid:66)(cid:84)(cid:1)(cid:74)(cid:79)(cid:74)(cid:85)(cid:74)(cid:66)(cid:85)(cid:70)(cid:69)(cid:1)(cid:71)(cid:80)(cid:83)(cid:1)(cid:69)(cid:74)(cid:84)(cid:70)(cid:66)(cid:84)(cid:70)(cid:1)
`(cid:81)(cid:83)(cid:80)(cid:72)(cid:83)(cid:70)(cid:84)(cid:84)(cid:74)(cid:80)(cid:79)(cid:15)(cid:1)(cid:49)(cid:83)(cid:70)(cid:13)(cid:1)(cid:67)(cid:70)(cid:71)(cid:80)(cid:83)(cid:70)(cid:1)(cid:85)(cid:73)(cid:70)(cid:1)(cid:71)(cid:74)(cid:83)(cid:84)(cid:85)(cid:1)(cid:74)(cid:79)(cid:71)(cid:86)(cid:84)(cid:74)(cid:80)(cid:79)(cid:28)(cid:1)(cid:49)(cid:83)(cid:70)(cid:1)(cid:42)(cid:42)(cid:13)(cid:1)(cid:67)(cid:70)(cid:71)(cid:80)(cid:83)(cid:70)(cid:1)(cid:85)(cid:73)(cid:70)(cid:1)(cid:84)(cid:70)(cid:68)(cid:80)(cid:79)(cid:69)(cid:1)(cid:74)(cid:79)(cid:71)(cid:86)(cid:84)(cid:74)(cid:80)(cid:79)(cid:15)
`
`cells from patients number 3 and number 5 indicated that both
`CD4+ and CD8+ T cells can contribute to the in vivo expansion of
`CAR.CD19-28ζ+ T cells (Supplemental Figure 3).
`Two patients (number 1 and number 3) with stable disease and
`one patient (number 5) with minimal progression at 1 site of dis-
`ease after the first infusion were treated with the same T cell prod-
`ucts 6 or more weeks after the first infusion to increase potential
`clinical benefits (Supplemental Table 1). The differential pattern
`of molecular signals over time, after the second infusion, was simi-
`lar to that observed after the first infusion (Figure 2), such that
`only CAR.CD19-28ζ+ T cells showed any discernible expansion.
`This suggests that the decline of T cell persistence after the first
`infusion was unlikely to have been determined by rapid immune
`elimination of the gene-modified T cells (19).
`Conceivably, the differences we observed in the expansion and
`survival of these CAR-modified T cells could be explained by the
`preferential accumulation of CAR.CD19ζ+ T cells in malignant
`
`tissues, as compared with that of CAR.CD19-28ζ+ T cells. We
`therefore analyzed tissue sections taken from a cutaneous lesion
`of patient number 5 at 2 weeks after the second T cell infusion.
`Phenotypic analysis of lymphocytes from this tissue revealed the
`presence of CAR+ T cells (Figure 3), which, by Q-PCR analysis,
`proved to be exclusively CAR.CD19-28ζ+ T cells, corresponding to
`the preponderance of these cells in peripheral blood.
`Our results clearly demonstrate that CD28 costimulation
`improves the in vivo expansion and persistence of CAR-modified
`T cells in the peripheral blood as compared with that of T cells
`with a single signaling domain. Moreover, the presence of CAR.
`CD19-28ζ+ T cells in a cutaneous tumor biopsy suggests that the
`superior expansion and persistence conferred by the second-gen-
`eration CAR in peripheral blood may extend to cells infiltrating
`tumor sites. Although the gains in T cell responses achieved with
`CD28 costimulation are encouraging, they still may be too short
`lived to produce meaningful clinical benefits. Indeed, despite
`
`(cid:18)(cid:25)(cid:19)(cid:21)
`
`The Journal of Clinical Investigation http://www.jci.org Volume 121 Number 5 May 2011
`
`UPenn Ex. 2010
`Miltenyi v. UPenn
`IPR2022-00855
`
`
`
`(cid:67)(cid:83)(cid:74)(cid:70)(cid:71)(cid:1)(cid:83)(cid:70)(cid:81)(cid:80)(cid:83)(cid:85)
`
`(cid:46)(cid:70)(cid:85)(cid:73)(cid:80)(cid:69)(cid:84)
`Patients. This study was open to
`patients with recurrent or refracto-
`ry NHL or those unable to receive
`or complete standard therapy.
`We obtained 30–60 ml peripheral
`blood for the production of gene-
`modified T cells, under current
`“good-tissue practice” conditions.
`The investigation was approved by
`the US Food and Drug Adminis-
`tration, the Recombinant DNA
`Advisory Committee, and the
`Institutional Review Board of Bay-
`lor College of Medicine. All par-
`ticipants gave informed consent
`upon enrollment.
`T cell infusions. All individuals
`received the T cell products at
`least 6 weeks after the last chemo-
`therapy treatment. At the time of
`infusion, patients had measurable
`disease by imaging studies (CT or
`PET scan) or by physical examina-
`tion (skin lesion in 1 patient). T
`cell products expressing either the
`CAR.CD19ζ or CAR.CD19-28ζ
`transgenes were administered
`simultaneously to each patient
`(Supplemental Table 1). Second infusions were allowed if there was evidence
`of clinical benefit (including stable disease or partial response) at 6 weeks
`after the first infusion as assessed by Response Evaluation Criteria in Solid
`Tumors (24). We assessed toxicity on the basis of patient interviews, physical
`examinations, and laboratory tests of organ function at 1, 2, 4, and 6 weeks
`and 3, 6, 9, and 12 months after infusion.
`Generation of retroviral constructs. The scFv domain targeting the CD19 anti-
`gen was provided by Heddy Zola (Child Health Research Institute, Women’s
`and Children’s Hospital, Adelaide, South Australia, Australia) (16). CAR.
`CD19ζ and CAR.CD19-28ζ vectors were generated as previously described
`(25). A spacer region derived from the human IgG1-CH2CH3 domain was
`cloned in-
Accessing this document will incur an additional charge of $.
After purchase, you can access this document again without charge.
Accept $ Charge
Still Working On It
This document is taking longer than usual to download. This can happen if we need to contact the court directly to obtain the document and their servers are running slowly.
Give it another minute or two to complete, and then try the refresh button.
A few More Minutes ... Still Working
It can take up to 5 minutes for us to download a document if the court servers are running slowly.
Thank you for your continued patience.
This document could not be displayed.
We could not find this document within its docket. Please go back to the docket page and check the link. If that does not work, go back to the docket and refresh it to pull the newest information.
Your account does not support viewing this document.
You need a Paid Account to view this document. Click here to change your account type.
Your account does not support viewing this document.
Set your membership
status to view this document.
With a Docket Alarm membership, you'll
get a whole lot more, including:
- Up-to-date information for this case.
- Email alerts whenever there is an update.
- Full text search for other cases.
- Get email alerts whenever a new case matches your search.
One Moment Please
The filing “” is large (MB) and is being downloaded.
Please refresh this page in a few minutes to see if the filing has been downloaded. The filing will also be emailed to you when the download completes.
Your document is on its way!
If you do not receive the document in five minutes, contact support at support@docketalarm.com.
Sealed Document
We are unable to display this document, it may be under a court ordered seal.
If you have proper credentials to access the file, you may proceed directly to the court's system using your government issued username and password.
Access Government Site
