(12) NACH DEM VERTRAG UBER DIE INTERNATIONALE ZUSAMMENARBEIT AUF DEM GEBIET DES
`PATENTWESENS(PCT) VEROFFENTLICHTE INTERNATIONALE ANMELDUNG
`
`(19) Weltorganisationfiir geistiges Eigentum
`Internationales Biiro
`
`(43) Internationales Veréffentlichungsdatum
`15. Juli 2004 (15.07.2004)
`
` (10) Internationale Veréffentlichungsnummer
`
`WO 2004/059556 A2
`
`(51) Internationale Patentklassifikation’:
`
`GO6F 19/00
`
`(21) Internationales Aklenzeichen:
`
`PCTYEP2003/014850
`
`(22) Internationales Anmeldedatum:
`23. Dezember 2003 (23.12.2003)
`
`(25) Einreichungssprache:
`
`(26) Veréffentlichungssprache:
`
`Deutsch
`
`Deutsch
`
`(30) Angaben zur Prioritat:
`102 60 805.9
`23. Dezember 2002 (23.12.2002)
`
`DE
`
`(71) Anmelder(fir alle Bestimmungsstaaten mit Ausnahme von
`US): GENEART GMBH[DE/DE]; Josef-Engert-Strasse
`9, 93053 Regensburg (DE).
`
`(72) Erfinder; und
`fiir US): RAAB, David
`(nur
`(75) Erfinder/Anmelder
`[DE/DE]; Gottfried Kélwel Platz 1, 93176 Beratshausen
`(DE). GRAF, Marcus [DE/DE]; Taubengasschen 1, 93047
`Regensburg (DE). NOTKA,Frank [DE/DE]; Franziskan-
`erplatz 19, 93059 Regensburg (DE). WAGNER, Ralf
`[DE/DE]; Roter Brach Weg 29, 93049 Regensburg (DE).
`
`(74) Anwilte: SCHOHE,Stefan usw.; Boehmert & Boehmert,
`Hollerallee 32, 28209 Bremen (DE).
`
`(81) Bestimmungsstaaten (national): AE, AG, AL, AM,AT,
`AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, BZ, CA, CH, CN, CO, CR,
`CU, CZ, DE, DK, DM, DZ, EC, EB, ES, FI, GB, GD, GE,
`GH, GM, HR, HU,ID,IL, IN, IS, JP, KE, KG, KP, KR,
`KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MA, MD, MG, MK,
`MN, MW, MX, MZ, NI, NO, NZ, OM, PG, PH, PL, PT,
`RO, RU, SC, SD, SE, SG, SK, SL, SY, TJ, TM, TN, TR,
`TT, TZ, UA, UG, US, UZ, VC, VN, YU, ZA, ZM, ZW.
`
`(84) Bestimmungsstaaten (regional): ARIPO Patent (BW, GH,
`GM, KE, LS, MW, MZ, SD, SL, SZ, TZ, UG, ZM, ZW),
`eurasisches Patent (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU,TJ,
`‘TM), europdisches Patent (Al, BE, BG, CH, CY, CZ, DE,
`DK, EE, ES, FI, FR, GB, GR, HU, IE, IT, LU, MC, NL,
`PT, RO, SE, SI, SK, TR), OAPI Patent (BF, BJ, CF, CG,
`CI, CM, GA, GN, GQ, GW, ML, MR, NE, SN, TD, TG).
`
`Veroffentlicht:
`ohneinternationalen Recherchenbericht und erneut zu ver-
`6ffentlichen nach Erhalt des Berichts
`
`Zur Erkldrung der Zweibuchstaben-Codes und der anderen Ab-
`kiirzungen wird auf die Erklarungen ("Guidance Notes on Co-
`des and Abbreviations") am Anfang jeder reguldren Ausgabe der
`PCT-Gazette verwiesen.
`
`(54) Title: METHOD AND DEVICE FOR OPTIMIZING A NUCLEOTIDE SEQUENCE POR THE PURPOSE OF EXPRESSION
`OF A PROTEIN
`
`(54) Bezeichnung: VERFAREN UND VORRICHTUNG ZUM OPTIMIEREN EINER NUCLEOTIDSEQUENZ ZUR EXPRES-
`SION EINES PROTEINS
`
`(57) Abstract: The invention relates to a method for optimizing a nucleotide sequence for the purpose of expression of a protein on
`the basis of the amino acid sequenceofsaid protein. According to the inventive method, atest sequence with m optimization positions
`is determined for a defined region, in which positions the codon usage is varied. The optimum codon usage on said optimization
`positions is determined by means of a power function and one or more codonsof said optimum usage are determined as the codons
`of the optimized nucleotide sequence. These steps are iterated, while the codons of the optimized nucleotide sequence determined
`in the preceding steps remain unchanged during the subsequent iteration steps. The invention further relates to a device for carrying
`out said method.
`
`(57) Zusammenfassung: Die Erfindungbetrifft ein Verfahren zum Optimieren einer Nucleotidsequenz zur Expression eines Pro-
`& teins auf der Grundlage der Aminosiurensequenz des Proteins, bei welchem fiir einen beslimmten Bereich eine Testsequenz mit m
`& Optimicrungspositionenfestgelegt wird, auf denen dic Codonbesctzungvariiert wird, wobci mittels ciner Giitefunktion dic optimale
`Codonbesetzung auf diesen Optimierungspositionen ermittelt wird und ein oder mehrere Codons dieser optimalen Besetzung als
`Codons der optimierten Nucleotidsequenz festgelegt werden. Diese Schritte werdeniteriert, wobei bei nachfolgenden Iterations-
`schritten die in vorangehenden Schritten festgelegten Codons der optimierten Nucleotidsequenz unverindert bleiben. Die Erfindung
`betrifft weiterhin eine Vorrichtung zur Durchfiihrung dieses Verfahrens.
`
`
`
`4/059556A2IMMKIINAITAUNACNTTTUETACT
`
`

`

`WO 2004/059556
`
`PCT/EP2003/014850
`
`Verfahren und Vorrichtung zum Optimieren einer Nucleotidsequenz zur Expression eines
`
`Proteins
`
`Die Erfindung betrifft allgemein die Erzeugung synthetischer DNS-Sequenzen und deren
`
`Verwendung zur Erzeugung von Proteinen, indem diese DNS-Sequenzen in ein Expressions-
`
`system, zum Beispiel in einen Wirtsorganismus/eine Wirtszelle oder cin System fiir eine In-
`
`vitro-Expression eingebracht werden, der bzw. die das entsprechende Protein exprimiert. Sie
`
`betrifft insbesondere Verfahren, bei denen eine synthetische Nucleotidsequenz fiir das jewei-
`
`lige Expressionssystem, also zum Beispiel fiir einen Organismus/fiir eine Wirtszelle, mit Hilfe
`
`eines Computers optimiert wird.
`
`Eine Technik zur Herstellung und Synthetisierung von Proteinen ist das Klonen und Expri-
`
`mieren der dem Protein entsprechenden Gensequenz in heterologen Systemen, z.B. Escheri-
`
`chia coli oder Hefe. Natiirlich vorkommende Gene sind fiir diesen Zweck allerdings haufig
`
`suboptimal. Da in einer DNS-Sequenz, die ein Protein exprimiert, jeweils ein Triplett von
`
`Basen (Codon) eine Aminosaure exprimiert, ist es méglich, eine kiinstliche DNS-Sequenz zur
`
`Expression des gewiinschten Proteins zu synthetisieren und fiir das Klonen und Exprimieren
`
`des Proteins zu verwenden. Ein Problem bei diesem Vorgehen besteht darin, da} einer vorge-
`
`gebenen Aminosdurensequenz keine eindeutige Nucleotidsequenz entspricht. Dies wird als
`
`Degeneriertheit des genetischen Codes bezeichnet. Unterschiedliche Organismen verwenden
`
`Codons fiir die Expression einer Aminoséure mit unterschiedlicher Haufigkeit (sogenannte
`
`Codonusage). In der Regel gibt es in einem gegebenen Organismus ein Codon,das tiberwie-
`
`gend verwendet wird und ein oder mehrere Codons, welche mit vergleichsweise geringer
`
`Haufigkeit von dem Organismus zur Expression der entsprechenden Aminosdure verwendet
`
`werden. Dadie synthetisierte Nucleotidsequenz in einem bestimmten Organismus verwendet
`
`werdensoll, sollte die Wahl der Codons an die Codon usage des entsprechenden Organismus
`
`angepabt sein. Eine weitere wichtige GréBe ist der GC-Gehalt (Gehalt der Basen Guanin und
`
`Cytosin in ciner Sequenz). Weitere Faktoren, welche das Expressionsergebnis beeinflussen
`
`kénnen, sind DNS-Motive und Wiederholungen oder invers komplementiére Wiederholungen
`
`in der Basensequenz. Bestimmte Basenabfolgen erzeugen in einem gegebenen Organismus
`
`

`

`WO 2004/059556
`
`PCT/EP2003/014850
`
`-2-
`
`bestimmte Funktionen, die innerhalb einer codierenden Sequenz nicht erwiinscht sein kénnen.
`
`Beispiele sind cis-aktive Sequenzmotive wie Spleifstellen oder Transkriptionsterminatoren.
`
`Das unbeabsichtigte Vorhandensein eines bestimmten Motivs kann die Expression reduzieren
`
`oder ganz unterdriicken oder sogar fiir den Wirtsorganismus eine toxische Wirkung haben.
`
`Sequenzwiederholungen kénnen zu einer geringeren genetischen Stabilitét fiihren und er-
`
`schweren die Synthese repetitiver Abschnitte aufgrund der Gefahr von Fehlhybridisierungen.
`
`Invers komplementare Wiederholungen kénnen zur Bildung von unerwiinschten Sekundar-
`
`strukturen auf der RNA-Ebene oder cruciformer Strukturen auf DNS-Ebene fiihren, welche
`
`die Transkription behindern und zu genetischer Instabilitat filhren, bzw. die Translationseffi-
`
`zienz negativ beeinflussen kénnen.
`
`Ein synthetisches Gen sollte daher hinsichtlich der Codon usage und des GC-Gehalts opti-
`
`miert sein und andererseits die mit DNS-Motiven sowie Sequenzwiederholungen und invers
`
`komplementaéren Sequenzwiederholungen verbundenen Probleme weitgehend vermeiden.
`
`Diese Erfordernisse lassen sich in der Regel jedoch nicht gleichzeitig und in optimaler Weise
`
`erflillen. Beispielsweise kann eine Optimierung auf die optimale Codon usage zu einer stark
`
`repetitiven Sequenz und einem erheblichen Abweichen von dem gewtinschten GC-Gehalt
`
`filhren. Es gilt daher, einen mdglichst optimalen Kompromifs zwischen der Erftillung der ver-
`
`schiedenen Erfordernisse herbeizufiihren. Die groBe Anzahl von Aminosduren in einem Pro-
`
`tein fiihrt jedoch zu einer kombinatorischen Explosion der Zahl der méglichen DNS-
`
`Sequenzen, welche — im Prinzip — das gewtinschte Protein exprimieren kénnen. Aus diesem
`
`Grund wurden verschiedene computergestiitzte Verfahren zum Ermitteln einer optimalen Co-
`
`donsequenz vorgeschlagen.
`
`P.S. Sarkar und Samir K. Brahmachari, Nucleic Acids Research 20 (1992), 5713 beschreiben
`
`Untersuchungen zur Rolle der Wahl! der Codons bei der Bildung bestimmter rdéumlicher
`
`Strukturen einer DNS-Sequenz. Hierbei wurden alle méglichen degenerierten Nucleotidse-
`
`quenzen generiert. Eine Bewertung der Sequenzen hinsichtlich des Vorhandenseins von
`
`strukturellen Motiven und strukturbildender Abschnitte erfolgte durch einen Computer unter
`
`Verwendung einer Wissensbasis. Die Verwendung einer Giitefunktion ist nicht offenbart.
`
`D.M. Hoover und J. Lubkowski, Nucleic Acid Research 30 (2002), Nr. 10 e43 schlagt ein
`computergesttitztes Verfahren vor, bei dem die Nucleotidsequenz in eine ungerade Anzahl
`
`

`

`WO 2004/059556
`
`PCT/EP2003/014850
`
`-3-
`
`von Abschnitten unterteilt wird, fiir die jeweils eine Giitefunktion (Score) berechnet wird. In
`die Giitefunktion gehen u.a. die Codon usage, die Méglichkeit der Bildung von Haarnadel-
`strukturen und die Abweichungen von der gewiinschten Schmelztemperatur ein. Der Wert der
`Giitefunktion fir die Gesamtsequenz bestimmtsich aus der Summe der Werte der Giitefunk-
`tion fir die einzelnen Abschnitte. Die Besetzung mit Codons innerhalb eines Abschnittes wird
`durch ein sogenanntes Monte-Carlo-Verfahren optimiert. Dabei werdenstatistisch Codonpo-
`sitionen ausgewdhlt, bei denen das Codon einer Ausgangssequenz durch ein statistisch aus-
`gewahltes dquivalentes Codon ersetzt wird. Gleichzeitig werden in einer Iteration auch die
`Grenzen der Abschnitte neu definiert. Auf diese Weise wird eine vollstindige Gensequenz
`statistisch generiert. Ist der Wert der Giitefunktion fiir die Gesamtsequenz kleiner als die bis-
`herige Sequenz, wird die neue Sequenz beibehalten.Ist er gréRer, wird mit einer gewissen
`Wahrscheinlichkeit die neue Sequenz beibehalten, wobei diese Wahrscheinlichkeit durch eine
`Boltzmann-Statistik kontrolliert wird. Wenn sich innerhalb einer vorbestimmten Anzahl von
`Iterationen die Sequenz nicht andert, wird diese Sequenzals optimale Sequenz bewertet.
`
`Derartige statistische Verfahren haben den Nachteil, daft sic stark von der Wahl der Konver-
`genzkriterien abhangen.
`
`Es ist die Aufgabe der Erfindung,ein alternatives Verfahren zum Optimieren einer Nucleo-
`tidsequenz zur Expression eines Proteins auf der Grundlage der Aminosauresequenz des Pro-
`teins zur Verftigung zu stellen, welches sich mit relativ geringem Speicherplatz und relativ
`geringer Rechenzeit auf einem Computer implementieren 148t und welches insbesondere
`Nachteile der statistischen Verfahren vermeidet.
`
`Erfindungsgem&8 wird diese Aufgabe durch ein Verfahren zum Optimieren einer Nucleo-
`tidsequenz zur Expression eines Proteins auf der Grundlage der Aminosdurensequenz des
`Proteins geldst, welches die folgenden auf einem Computer durchgefiihrten Schritte umfaBt:
`-
`Generieren einer ersten Testsequenz von n Codons, welche n aufeinanderfolgenden
`Aminosauren in der Proteinsequenz entsprechen, wobei n eine natiirliche Zahl und
`kleiner oder gleich N, der Zahl der Aminosauren der Proteinsequenz,ist,
`Festlegen von m Optimierungspositionen in der Testsequenz, welche der Position von
`m Codons, insbesondere von m aufeinanderfolgenden Codons, entsprechen, an denen
`
`-
`
`

`

`WO 2004/059556
`
`PCT/EP2003/014850
`
`-4-
`
`-
`
`-
`
`-
`
`-
`
`die Besetzung mit einem Codon, bezogen auf die Testsequenz, optimiert werden soll,
`wobei m <n und m <N ist,
`Generieren einer oder mehrerer weiterer Testsequenzen aus der ersten Testsequenz,
`indem an einer oder mehreren der m Optimierungspositionen ein Codon der ersten
`Testsequenz durch ein anderes Codonersetzt wird, welches dieselbe Aminosaure ex-
`primiert,
`Bewerten jeder der Testsequenzen mit einer Gitefunktion und Ermitteln der hinsicht-
`lich der Giitefunktion optimalen Testsequenz,
`Festlegen von p Codons der optimalen Testsequenz, welche sich an einer der m Opti-
`mierungspositionen befinden, als Ergebniscodons, welche die Codons der optimierten
`Nucleotidsequenz an den Positionen bilden, die der Position der besagten p Codonsin
`der Testsequenz entspricht, wobeip eine natiirliche Zahl und p < m ist,
`Iterieren der vorangehendenSchritte, wobei in jedem Iterationsschritt die Testsequenz
`an den Positionen, welche Positionen von festgelegten Ergebniscodons in der opti-
`mierten Nucleotidsequenz entsprechen, das entsprechende Ergebniscodon enthdlt und
`die Optimierungspositionen von Positionen von Ergebniscodons verschiedensind.
`
`Gemder bevorzugten Ausfiihrungsform der Erfindung werden die vorangehend genannten
`Schritte so oft iteriert, bis alle Codons der optimierten Nucleotidsequenz festgelegt, d.h. mit
`Ergebniscodonsbesetzt worden sind.
`
`ErfindungsgemaB wird also die Sequenz nicht insgesamt, sondern sukzessiv auf Teilbereichen
`optimiert. Die in einem Iterationsschritt als optimal festgelegten p Ergebniscodons werdenin
`den nachfolgenden Iterationsschritten nicht mehr verandert und vielmehr bei den jeweiligen
`Optimierungsschritten als gegeben vorausgesctzt. Vorzugsweise ist die Anzahl der Ergeb-
`niscodons, welche auf diese Weise fiir die weiteren Iterationen festgelegt und als vorgegeben
`behandelt werden, kleiner als die Anzahl m der Optimierungspositionen, an denen in einem
`Iterationsschritt die Codons variiert werden. Zumindest in der MehrzahlderIterationsschritte,
`bei einer besonderen Ausfihrungsform beiallen Iterationsschritten auBer dem ersten, ist wie-
`derum m kleiner als die Zahl der Codons der Testsequenz (n). Dies gestattet es, nicht nur lo-
`kale Effekte auf den m variierten Positionen, sondern auch langerreichweitige Korrelationen,
`2.B. im Zusammenhang mit der Entstehung von RNA-Sekundarstrukturen, zu berticksichti-
`
`gen.
`
`

`

`WO 2004/059556
`
`PCT/EP2003/014850
`
`-5-
`
`Gemaf den derzeit bevorzugten Ausfithrungsformen liegt m im Bereich von 3 bis 20, vor-
`zugsweise im Bereich von 5 bis 10. Bei dieser Wahl dieses Parameters kann die Variation der
`Codons mit einem akzeptablen Aufwand an Speicher und Rechenzeit durchgefihrt werden
`und gleichzeitig eine gute Optimierung der Sequenzerreicht werden.
`
`Gema8 einer Ausfiihrungsform mu m in den verschiedenen Iterationsschritten nicht gleich
`sein, sondern kann vielmehr auch in unterschiedlichen Iterationsschritten verschieden sein. Es
`kann auch vorgesehensein, in einem Iterationsschritt die Variation der Testsequenz ftir ver-
`schiedene Werte von m durchzuftihren und ggf. nur das Optimierungsergebnisfiir einen Wert
`von m zu beriicksichtigen, um Einfliisse der Gro8e m auf das Optimierungsergebnis zu redu-
`zieren bzw. um zu tiberpriifen, ob eine VergréBerung der Zahl m zu einer Anderung des Er-
`
`gebnissesfiihrt.
`
`Gemaf der bevorzugten Ausfiihrungsform sind die m Optimierungspositionen oder zumindest
`ein Teil davon zusammenhangend undbilden somit ein Variationsfenster in der Testsequenz,
`
`auf welchem die Codonbesetzung variiert wird.
`
`Die Erfindung kann insbesondere vorsehen, da in zwei oder mehr aufeinanderfolgenden Ite-
`rationsschritten ein Teil der m Optimierungpositionen, auf welchen die Codons variiert wer-
`den, identisch sind. Sind die m Positionen zusammenhangend, bedeutet dies, daB das Variati-
`onsfenster bei einem Iterationsschritt mit dem Variationsfenster eines vorangehendenIterati-
`
`onsschrittes tiberlappt.
`
`Die Erfindung kann vorsehen, da8 in einem oder mehrerenIterationsschritten die m Optimie-
`rungspositionen der Testsequenzen unmittelbar auf ein oder mehrere Ergebniscodons folgen,
`welche als Teil der optimierten Nucleotidsequenz festgelegt worden sind.
`
`Die Erfindung kann ebenfalls vorsehen, dain einem oder mehreren Iterationsschritten die p
`Codons, die als Ergebniscodons der optimierten Nucleotidsequenz festgelegt werden, p auf-
`einanderfolgende Codons sind, die vorzugsweise unmittelbar auf ein oder mehrere Ergeb-
`niscodonsfolgen, welche als Teil der optimierten Nucleotidsequenz in einem friiheren Schritt
`festgelegt worden sind.
`
`

`

`WO 2004/059556
`
`PCT/EP2003/014850
`
`-6-
`
`Die Erfindung kann vorsehen, dai die Nucleotidsequenz von einem ihrer Enden her optimiert
`wird. Insbesondere kann die Erfindung vorsehen, daf in jedem Iterationsschritt die Lange der
`Testsequenz des vorherigenIterationsschritts um eine bestimmte Anzahl Codons,die in unter-
`schiedlichen Iterationen verschieden sein kann, vergréBert wird, bis n = N ist. Ist n = N und
`die Zahl derjenigen Positionen,die in der Testsequenz nicht mit Ergebniscodonsbesetzt sind,
`kleiner oder gleich dem Wert von m,der in den vorangehenden Iterationen verwendet wurde,
`oderliegt diese Zahl, bei Verwendung unterschiedlicher Werte von m in verschiedenen Itera-
`tionen, im Bereich der in Frage kommenden Werte von m, kann in dem entsprechendenItera-
`tionsschritt p = m gesetzt werden, wobei m gleichzeitig die Zahl der noch nicht festgelegten
`Codonsist. Die als optimal aufgefundene Besetzung der Optimierungspositionen wird dann
`fiir die Ergebniscodons an diesen Optimierungspositionen tibernommen. Dies gilt insbesonde-
`re dann, wenn fiir jede mdgliche Kombination von Besetzungen der Optimierungspositionen
`eine Testsequenz generiert wird.
`
`Es kann jedoch auch vorgesehensein, daB der Bereich der Testsequenz innerhalb der gesam-
`ten Sequenz in einem Iterationsschritt nicht oder nicht volistandig den Bereich einer Testse-
`quenz in einem vorherigen Iterationsschritt umfalt. Beispielsweise kann die Testsequenz
`selbst ein Fenster auf der Gesamtsequenz, z.B. cin Fenster fester Lange, bilden, das im Laufe
`der verschiedenen Iterationen auf der Gesamtsequenz verschoben wird.
`
`Gemi8 einer bevorzugten Ausfihrungsform wird die Testsequenz nach jedem Schritt um p
`Codonsverlaingert, wobei insbesonderemfir alle Iterationsschritte konstant sein kann.
`
`Analog zu der vorangehend beschriebenen Ausfithrungsform der Erfindung kann auch vorge-
`sehen sein, daB die Nucleotidsequenz von einer Stelle in ihrem Inneren her optimiert wird.
`Dies kann z.B. in der Art geschehen, daf eine anfangliche Testsequenz, welche einem Bereich
`im Inneren der zu optimierenden Nucleotidsequenz entspricht, zuniachst nach einer Seite suk-
`zessiv vergroBert wird, bis das Ende der zu optimierenden Nucleotidsequenz oder ein anderer
`vorgegebener Punktder zu optimierenden Nucleotidsequenz erreicht ist, und dann die Testse-
`quenz zu der anderen Seite hin vergréBert wird, bis dort das andere Ende der zu optimieren-
`den Nucleotidsequenz oder ein anderer vorgegebener Punkt der zu optimierenden Nucleo-
`
`tidsequenz erreichtist.
`
`

`

`WO2004/059556
`
`PCT/EP2003/014850
`
`-7-
`
`Die Erfindung kann auch vorsehen, da die Testsequenzen in einem Iterationsschritt aus einer
`optimierten oder anderweitig festgelegten Teilsequenz der Lange q und zwei auf beiden Sei-
`ten daran anschlieBenden Variationsbereichen mit einer Lange von m, bzw. m2 Codons be-
`steht, wobei q+m;+m, =ngilt. Die Besetzung der Variationsbereiche kann fiir beide Variati-
`onsbereiche gemeinsam optimiert werden, indem die Codons auf den m, und m, Platzen
`gleichzeitig variiert und optimiert werden. Vorzugsweise werden in einem solchen Fall in
`jedem Iterationsschritt p; und p2 Codons in dem ersten und zweiten Variationsbereich festge-
`legt, welche der weiteren Iteration als gegeben zugrunde gelegt werden. Es kann jedoch auch
`vorgesehensein, dali die beiden Variationsbereiche unabhangig voneinandervariiert und op-
`timiert werden. Beispielsweise kann vorgesehen sein, das die Besetzung nur in einem der
`beiden Variationsbereiche variiert wird und nur in dem einen Bereich Codonsfestgelegt wer-
`den, bevor die Variation und Optimierung in den zweiten Bereich stattfindet. In diesem Fall
`werden die p, festgelegten Codons in dem ersten Bereich bei der Optimierung des zweiten
`Bereichs als gegeben vorausgesetzt. Dieses Vorgehenist dann sinnvoll, wenn allenfalls gerin-
`ge Korrelationen zwischen den beiden Bereichen zu erwarten sind.
`
`Gemaf dieser Ausfiihrungsform kann vorgesehensein, dai die Nucleotidsequenz von einem
`Punkt oder einem Bereich im Inneren der Sequenz ausgehendoptimiert wird.
`
`Die Erfindung kann insbesondere vorsehen, da® in jedem Iterationsschritt der Bereich der
`Testsequenz auf der Gesamtsequenz den Bereich der Testsequenzen in allen vorangchenden
`Iterationsschritten umfaft und der Bereich einer Testsequenz in zumindest einigen der voran-
`gehendenIterationsschritte jeweils im Inneren oder jeweils am Rand des Bereichs der Testse-
`quenz in dem aktuellenIterationsschritt liegt.
`
`Die Erfindung kann vorsehen, da die Nucleotidsequenz auf verschiedenen Teilbereichen
`unabhingig optimiert wird. Die optimierte Nucleotidsequenz kann dann die Kombination der
`verschiedenen optimierten Teilsequenzen sein. Es kann auch vorgesehen sein, dai zumindest
`ein Teil der jeweiligen Ergebniscodons von zwei oder mehr optimierten Teilbereichen als
`Bestandteil einer Testsequenz in einer oder mehrerenIterationen verwendet wird.
`
`GemaB einer bevorzugten Ausfiihrungsform der Erfindung ist vorgesehen, da in einem Ite-
`rationsschritt Testsequenzen mit allen méglichen Codonbesetzungen fiir die m Optimierungs-
`positionen aus der ersten Testsequenz generiert werden und die optimale Testsequenz unter
`
`

`

`WO 2004/059556
`
`PCT/EP2003/014850
`
`-8-
`
`allen méglichen Testsequenzen, bei denen an einer oder mehreren der m Optimierungsposi-
`tionen ein Codon durch ein anderes Codon, welches dieselbe Aminosdure exprimiert, ersetzt
`
`wurde, ermittelt wird.
`
`Gema& einer Ausfithrungsform der Erfindung ist die zum Bewerten der Testsequenzen ver-
`wendete Giitefunktion bei allen oder zumindest der Mehrzahl derIterationen gleich. Die Er-
`findung kann jedoch auch vorsehen, unterschiedliche Gititefunktionen in unterschiedlichen
`Iterationen, zum Beispiel in Abhangigkeit von der Lange der Testsequenzen, zu verwenden.
`
`DaserfindungsgemaBe Verfahren kann insbesondere die folgenden Schritte umfassen:
`-
`Bewerten jeder Testsequenz mit einer Giitefunktion,
`-
`Ermitteln eines Extremwertes innerhalb der Werte der Giitefunktion fiir alle in einem
`
`-
`
`Iterationsschritt generierten Teilsequenzen,
`Festlegen von p Codons der Testsequenz, welche dem extremalen Wert der Gewichts-
`funktion entspricht, als Ergebniscodons an den entsprechendenPositionen, wobeip ei-
`ne nattirliche Zahl und p < m ist.
`Die Giitefunktion kann so definiert sein, daB die Sequenz entweder umso néher an dem Opti-
`mumliegt, je groBer der Wert der Giitefunktion ist, oder umso naher an dem Optimum liegt,
`je kleiner ihr Wert ist. Entsprechend wird man bei dem Schritt des Ermittelns des Extrem-
`wertes das Minimum oder das Maximum der Giitefunktion unter den generierten Codonse-
`
`quenzen ermitteln.
`
`Die Erfindung kann vorsehen, da8 die Giitefunktion eines oder mehrere der folgenden Krite-
`rien beriicksichtigt:
`Codon usage fiir einen vorgegebenen Organismus, GC-Gehalt, Sequenzmotive, repetitive
`Sequenzen, Sekundarstrukturen, inverse Repeats.
`
`Die Erfindung kann insbesondere vorsehen, dal} die Giitefunktion eines oder mehrere derfol-
`genden Kriterien beriicksichtigt:
`insbesondere DNS/Protein-Interaktionsbindestellen und
`-
`cis-aktive Sequenz-Motive,
`RNS/Protein-Interaktionsbindestellen, bevorzugt SpleiBmotive, Transkriptionsfaktor-
`bindestellen, Transkriptionsterminatorenbindestellen, Polyadenylierungssignale, En-
`donucleaseerkennungssequenzen,
`immunomodulatorische DNS-Motive, Ribosomen-
`
`

`

`WO 2004/059556
`
`PCT/EP2003/014850
`
`-9-
`
`bindestellen, Erkennungssequenzenfiir rekombinationsaktive Enzyme, Erkennungsse-
`quenzen
`fiir DNS-modifizierende Enzyme, Erkennungssequenzen fiir RNS-
`modifizierende Enzyme, Sequenzmotive, die in einem vorgegebenen Organismus un-
`
`terreprasentiert sind.
`
`Die Erfindung kann auch vorsehen, daB& die Giitefunktion eines oder mehrere der folgenden
`Kriterien berticksichtigt:
`-
`Ausschlu8 oder weitgehender Ausschlu8 von invers komplementaren Sequenzidenti-
`titen von mehr als 20 Nukleotiden zum Transkriptom eines vorgegebenen Organis-
`
`-
`
`mus,
`Ausschlu8 oder weitgehender Ausschlu8 von Homologiebereichen von mehr als 1.000
`Basenpaaren, bevorzugt 500 Basenpaaren,starker bevorzugt 100 Basenpaaren zu einer
`vorgegebenen DNS-Sequenz, zum Beispiel zu dem Genom eines vorgegebenen Orga-
`nismus oder zu der DNS-Sequenz eines vorgegebenen Vektorkonstrukts.
`
`Daserste dieser beiden Kriterien betrifft den Ausschlu8 des als RNA-Indifferenz bekannten
`Mechanismus, mit dem ein Organismus RNA-Sequenzen mit mehr als 20 Nukleotiden exak-
`ter Identitat zu einer anderen RNA-Sequenz eliminiert oder deaktiviert. Mit dem zweiten
`Kriterium soll verhindert werden, da eine Rekombination, das heifit ein Einbau der Sequenz
`in das Erbgut des Organismus, oder eine Mobilisierung von DNS-Sequenzen durch Rekombi-
`nation mit anderen Vektorenstattfindet. Beide Kriterien kénnen als absolute AusschluBkrite-
`rien verwendet werden, d.h. Sequenzen, bei denen eines oder beide dieser Kriterien erfillt
`sind, werden nicht beriicksichtigt. Die Erfindung kann auch, wie nachfolgend noch genauer
`im Zusammenhang mit Sequenzmotiven erlautert wird, vorschen, da® diesen Kriterien ein
`Gewicht zugeordnetist, das betragsmafig gréfter ist als der gréSte Beitrag von Kriterien zu
`der Giitefunktion, welche keine Ausschlufikriterien sind.
`
`Die Erfindung kann auch, gegebenenfalls zusammen mit anderen Kriterien, das Kriterium
`vorsehen, da8 keine Homologiebereiche erzeugt werden, die mehr als 90 % Ahnlichkeit
`und/oder 99 % Identitat zu einer vorgegebenen DNS-Sequenz, zum Beispiel zu der entspre-
`chenden Genomsequenz des vorgegebenen Organismus oder zu der DNS-Sequenz eines vor-
`gegebenen Vektorkonstrukts aufweisen. Auch dieses Kriterium kann entweder als absolutes
`AusschluBkriterium realisiert sein oder in einer Weise, daB es einen sehr grofen Beitrag zu
`
`

`

`WO 2004/059556
`
`PCT/EP2003/014850
`
`-10-
`
`der Giitefunktion leistet, welcher den Beitrag anderer Kriterien, die nicht Ausschlu8kriterien
`
`sind, tiberwiegt.
`
`Insbesondere kann vorgesehen sein, daB die Giitefunktion eine Funktion von verschiedenen
`Einzeltermen, insbesondere eine Summe von Einzeltermenist, die jeweils ein Kriterium aus
`der folgenden Liste von Kriterien bewerten:
`Codon usagefiir einen vorgegebenen Organismus, GC-Gehalt, DNS — Motive, repetitive Se-
`quenzen, Sekundarstrukturen, inverse Repeats.
`
`‘
`
`Die besagte Funktion von Einzeltermen kann insbesondere eine Linearkombination von Ein-
`zeltermen oder eine rationale Funktion von Einzeltermen sein.Die genannten Kriterien mis-
`sen nicht notwendigerweise vollstandig in der Gewichtsfunktion beriicksichtigt werden. Es
`kann auch nurein Teil der Kriterien in der Gewichtsfunktion verwendet werden.
`
`Die verschiedenen Einzelterme in der besagten Funktion werden nachfolgend Kriteriumsge-
`
`wichte genannt.
`
`Die Erfindung kann vorschen, da8 das Kriteriumsgewicht betreffend die Codon Usage (CU
`Score) proportional zu 2; fei/femaxi 1St, wobei
`-
`f,; die Haufigkeit des an derStelle i der Testsequenz gesetzten Codons fiir den betref-
`fenden Organismus zur Expression der Aminosdure an der Stelle i der Aminosauren-
`sequenz des zu exprimierenden Proteins ist und
`fonaxi die Haufigkeit des Codonsist, welches in dem entsprechenden Organismus am
`haufigsten die Aminosdure an derStelle i exprimiert.
`
`Das MaB fei/femaxi ist als ,,Relative Adaptiveness* bekannt (vgl. P. M. Sharp, W. H. Li,
`Nucleic Acids Research 15 (3) (1987), 1281 bis 1295).
`
`Das lokale Gewicht des am haufigsten vorkommenden Codons wird dabei, unabhangig von
`der absoluten Haufigkeit, mit der dieses Codon vorkommt, auf einen bestimmten Wert, zum
`Beispiel 1, gesetzt. Damit wird vermieden, da die Positionen, an denen nur wenige Codons
`zur Auswahlstehen, starker zu dem Gesamtgewicht beitragen als diejenigen, an denen eine
`
`

`

`WO 2004/059556
`
`PCT/EP2003/014850
`
`-ll-
`
`gréBere Anzahl von Codons zur Expression der Aminosdure zur Auswahlstehen. Der Index i
`kann tiber die gesamten n Codonsder Testsequenz oder einen Teil davon laufen. Insbesondere
`kann in einer Ausfiihrungsform vorgesehen sein, daf i nur Uber die m Codons der Optimie-
`rungspositionen lauft.
`
`Die Erfindung kann vorsehen, dai das Kritertumsgewicht betreffend die Codonusage nurfiir
`die m Ordnungspositionen verwendet wird.
`
`Anstelle der Relative Adaptiveness kann auch die sogenannte RSCU (Relative Synonymous
`Codon Usage;vgl. P. M. Sharp, W.H.Li, a.a.0.) verwendet werden. Die RSCUfiir eine Co-
`donposition ist definiert durch
`
`RSCU, = fuidi/(Me fi)
`
`definiert, wobei die Summe im Nenneriiber alle Codonslauft, welche die Aminosdure an der
`Stelle i exprimieren und wobeidj die Zahl der Codonsangibt, welche die besagte Aminosdure
`exprimieren. Um ein Kriteriengewicht auf der Grundlage der RSCU zu definieren, kann vor-
`gesehen sein, dai die RSCU firdie jeweilige Testsequenz tiber alle Codons der Testsequenz
`oder einen Teil davon, insbesondere iiber die m-Codons der Optimierungspositionen, sum-
`miert wird. Der Unterschied zu dem von der Relative Adaptiveness abgeleiteten Kriteriums-
`gewicht besteht darin, daB bei dieser Gewichtung jede Codonposition mit dem Grad der De-
`generiertheit, di, gewichtet wird, so da solche Positionen, an denen mehr Codons zur Aus-
`wahlstehen, strker in das Kriteriumsgewicht eingehen als solche Positionen, an denen nur
`wenige Codons oder sogar nur ein einziges Codon zur Auswahlstehen.
`
`Bei den vorangehend beschriebenen Kriteriumsgewichten fiir die Codon-Usage wurde das
`arithmetische Mittel tiber die lokalen Gewichte (Relative Adaptiveness, RSCU) gebildet.
`
`Es kann auch vorgesehen sein, daB das Kriteriumsgewicht betreffend die Codon-Usage pro-
`portional zu den geometrischen Mittel der lokalen Relative Adaptiveness bzw. der lokalen
`RSCUist, so daB also gilt
`
`CUScore = K(II; RSCU))"”
`
`

`

`WO 2004/059556
`
`PCT/EP2003/014850
`
`-12-
`
`oder
`
`CUScore = K (Tife/femaxi)
`
`ist, wobei K ein Skalierungsfaktor ist und L die Anzahl der Positionen ist, tiber welche das
`Produkt gebildet wird. Auch hier kann das Produkt wiederiiber die gesamte Testsequenz oder
`einen Teil, insbesondere iiber die m Optimierungspositionen, gebildet werden.
`N
`
`In diesem Zusammenhangstellt die Erfindung auch ein Verfahren zum Optimieren einer Nu-
`kleotidsequenz zur Expression eines Proteins auf der Grundlage der Aminosauresequenz des
`Proteins zur Verfiigung, welches die folgenden auf einem Computer durchgefiihrten Schritte
`
`umfaft:
`-
`Generieren einer oder mehrerer Testsequenzen von n Codons, welche n aufeinander-
`folgende Aminosauren in der Proteinsequenz entsprechen, wobei n eine natiirlich Zahl
`kleiner odergleich N, der Zahl der Aminosduren der Proteinsequenz,ist,
`Bewerten der einen oder mehreren Testsequenzen auf der Grundlage einer Gtitefunkti-
`on, welche ein geometrisches oder arithmetisches Mittel der Relative Adaptiveness
`oder der RSCUiiber eine Anzahl von L Codonpositionen enthalt, wobei L kleiner oder
`
`-
`
`-
`
`gleich N ist,
`Generierung einer oder mehrerer neuer Testsequenzen in Abhingigkeit von dem Er-
`gebnis der besagten Bewertung.
`
`Dabei kann die Generierung einer oder mehrerer neuer Testfunktionen in der oben beschrie-
`benen Weise derart erfolgen, daB die neuen Testsequenzen eine bestimmte Anzahl aufgrund
`der vorangehendenIterationen festgelegte Ergebniscodons enthalten, aber z.B. auch so, daf
`eine bestimmte Testsequenz mit einer bestimmten Wahrscheinlichkeit, die von dem Wert der
`Giitefunktion abhangt, als Grundlagefiir weitere Iterationen, insbesondere die weitere Erzeu-
`gung von Testsequenzen, verwendet wird, wie dies bei Monte-Carlo-Verfahren derFallist.
`
`Wahrend die Qualitit eines Codons bei den obengenannten Verfahren durch die Nutzungs-
`haufigkeit im Transkriptom oder einem Gen-Referenzsetdes Expressionsorganismusdefiniert
`wird, kann die Giite eines bestimmten Codons alternativ auch durch die biophysikalischen
`
`

`

`WO 2004/059556
`
`PCT/EP2003/014850
`
`-13-
`
`Eigenschaften des Codons selbst beschrieben werden. So ist zum Beispiel bekannt, dal Co-
`dons mit einer mittleren Codon-Anticodon-Bindungsenergie besonders effizient translatiert
`werden. Als MaB fiir die translatorische Effizienz einer Testsequenz kann daher zum Beispiel
`der P2-Index verwendet werden, welcher das Verhdltnis der Haufigkeit von Codons mit mitt-
`lerer Bindungsenergie und Codons mit extrem starker bzw. schwacher Bindungsenergie an-
`gibt. Alternativ konnen auch experimentell oder durch theoretische Berechnungen gewonnene
`Daten zur translatorischen Effizienz oder translationsgenauigkeit eines Codons zur Giitebe-
`wertung genutzt werden. Die oben genannten Bewertungskriterien kénnen besonders dann