TruSeq™ DNA
`Sample Preparation Guide
`
`FOR RESEARCH USE ONLY
`
`ILLUMINA PROPRIETARY
`Catalog # PE-940-2001
`Part # 15005180 Rev. A
`November 2010
`
`00001
`
`EX1028
`
`

`

`Part # 15005180 Rev. A
`
`ii
`
`00002
`
`

`

`Notice
`
`This(cid:561)document(cid:561)and(cid:561)its(cid:561)contents(cid:561)are(cid:561)proprietary(cid:561)to(cid:561)Illumina,(cid:561)Inc.(cid:561)and(cid:561)its(cid:561)affiliates(cid:561)((cid:520)Illumina(cid:520)),(cid:561)and(cid:561)
`
`are(cid:561)intended(cid:561)solely(cid:561)for(cid:561)the(cid:561)contractual(cid:561)use(cid:561)of(cid:561)its(cid:561)customer(cid:561)in(cid:561)connection(cid:561)with(cid:561)the(cid:561)use(cid:561)of(cid:561)the(cid:561)
`product(s)(cid:561)described(cid:561)herein(cid:561)and(cid:561)for(cid:561)no(cid:561)other(cid:561)purpose.(cid:561)(cid:561)This(cid:561)document(cid:561)and(cid:561)its(cid:561)contents(cid:561)shall(cid:561)not(cid:561)
`be(cid:561)used(cid:561)or(cid:561)distributed(cid:561)for(cid:561)any(cid:561)other(cid:561)purpose(cid:561)and/or(cid:561)otherwise(cid:561)communicated,(cid:561)disclosed,(cid:561)or(cid:561)
`reproduced(cid:561)in(cid:561)any(cid:561)way(cid:561)whatsoever(cid:561)without(cid:561)the(cid:561)prior(cid:561)written(cid:561)consent(cid:561)of(cid:561)Illumina.(cid:561)(cid:561)Illumina(cid:561)does(cid:561)
`not(cid:561)convey(cid:561)any(cid:561)license(cid:561)under(cid:561)its(cid:561)patent,(cid:561)trademark,(cid:561)copyright,(cid:561)or(cid:561)common(cid:556)law(cid:561)rights(cid:561)nor(cid:561)similar(cid:561)
`rights(cid:561)of(cid:561)any(cid:561)third(cid:561)parties(cid:561)by(cid:561)this(cid:561)document.(cid:561)(cid:561)
`The(cid:561)instructions(cid:561)in(cid:561)this(cid:561)document(cid:561)must(cid:561)be(cid:561)strictly(cid:561)and(cid:561)explicitly(cid:561)followed(cid:561)by(cid:561)qualified(cid:561)and(cid:561)
`properly(cid:561)trained(cid:561)personnel(cid:561)in(cid:561)order(cid:561)to(cid:561)ensure(cid:561)the(cid:561)proper(cid:561)and(cid:561)safe(cid:561)use(cid:561)of(cid:561)the(cid:561)product(s)(cid:561)described(cid:561)
`herein.(cid:561)(cid:561)All(cid:561)of(cid:561)the(cid:561)contents(cid:561)of(cid:561)this(cid:561)document(cid:561)must(cid:561)be(cid:561)fully(cid:561)read(cid:561)and(cid:561)understood(cid:561)prior(cid:561)to(cid:561)using(cid:561)
`such(cid:561)product(s).
`FAILURE(cid:561)TO(cid:561)COMPLETELY(cid:561)READ(cid:561)AND(cid:561)EXPLICITLY(cid:561)FOLLOW(cid:561)ALL(cid:561)OF(cid:561)THE(cid:561)
`INSTRUCTIONS(cid:561)CONTAINED(cid:561)HEREIN(cid:561)MAY(cid:561)RESULT(cid:561)IN(cid:561)DAMAGE(cid:561)TO(cid:561)THE(cid:561)PRODUCT(S),(cid:561)
`INJURY(cid:561)TO(cid:561)PERSONS,(cid:561)INCLUDING(cid:561)TO(cid:561)USERS(cid:561)OR(cid:561)OTHERS,(cid:561)AND(cid:561)DAMAGE(cid:561)TO(cid:561)OTHER(cid:561)
`PROPERTY.
`ILLUMINA(cid:561)DOES(cid:561)NOT(cid:561)ASSUME(cid:561)ANY(cid:561)LIABILITY(cid:561)ARISING(cid:561)OUT(cid:561)OF(cid:561)THE(cid:561)IMPROPER(cid:561)USE(cid:561)OF(cid:561)
`THE(cid:561)PRODUCT(S)(cid:561)DESCRIBED(cid:561)HEREIN(cid:561)(INCLUDING(cid:561)PARTS(cid:561)THEREOF(cid:561)OR(cid:561)SOFTWARE)(cid:561)OR(cid:561)
`ANY(cid:561)USE(cid:561)OF(cid:561)SUCH(cid:561)PRODUCT(S)(cid:561)OUTSIDE(cid:561)THE(cid:561)SCOPE(cid:561)OF(cid:561)THE(cid:561)EXPRESS(cid:561)WRITTEN(cid:561)
`LICENSES(cid:561)OR(cid:561)PERMISSIONS(cid:561)GRANTED(cid:561)BY(cid:561)ILLUMINA(cid:561)IN(cid:561)CONNECTION(cid:561)WITH(cid:561)
`CUSTOMER(cid:519)S(cid:561)ACQUISITION(cid:561)OF(cid:561)SUCH(cid:561)PRODUCT(S).
`FOR(cid:561)RESEARCH(cid:561)USE(cid:561)ONLY
`©(cid:561)2010(cid:561)Illumina,(cid:561)Inc.(cid:561)All(cid:561)rights(cid:561)reserved.
`Illumina,(cid:561)illuminaDx,(cid:561)Solexa,(cid:561)Making(cid:561)Sense(cid:561)Out(cid:561)of(cid:561)Life,(cid:561)Oligator,(cid:561)Sentrix,(cid:561)GoldenGate,(cid:561)
`GoldenGate(cid:561)Indexing,(cid:561)DASL,(cid:561)BeadArray,(cid:561)Array(cid:561)of(cid:561)Arrays,(cid:561)Infinium,(cid:561)BeadXpress,(cid:561)VeraCode,(cid:561)
`IntelliHyb,(cid:561)iSelect,(cid:561)CSPro,(cid:561)GenomeStudio,(cid:561)Genetic(cid:561)Energy,(cid:561)HiSeq,(cid:561)HiScan,(cid:561)Eco,(cid:561)and(cid:561)TruSeq(cid:561)
`are(cid:561)registered(cid:561)trademarks(cid:561)or(cid:561)trademarks(cid:561)of(cid:561)Illumina,(cid:561)Inc.(cid:561)All(cid:561)other(cid:561)brands(cid:561)and(cid:561)names(cid:561)contained(cid:561)
`herein(cid:561)are(cid:561)the(cid:561)property(cid:561)of(cid:561)their(cid:561)respective(cid:561)owners.
`
`TruSeq DNA Sample Preparation Guide
`
`iii
`
`00003
`
`

`

`Notice
`
`Part # 15005180 Rev. A
`
`iv
`
`00004
`
`

`

`Revision History
`
`Part(cid:561)#
`
`Revision
`
`Date
`
`Description(cid:561)of(cid:561)Change
`
`15005180
`
`A
`
`November(cid:561)2010 Initial(cid:561)Release
`
`TruSeq DNA Sample Preparation Guide
`
`v
`
`00005
`
`

`

`vi
`
`Part # 15005180 Rev. A
`
`Revision History
`
`00006
`
`

`

`Table of Contents
`
`Notice . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . iii
`
`Revision History . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . v
`
`Table of Contents . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .vii
`
`List of Tables . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ix
`
`Chapter 1 Overview . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .11
`
`Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
`Audience and Purpose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
`
`Chapter 2
`
`Standard Operating Procedures . . . . . . . . . . . . . . . .15
`
`Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
`Acronyms . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
`Best Practices . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
`DNA Input Recommendations . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
`In-Line Control DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
`Tracking Tools . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
`Kit Contents . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
`Consumables and Equipment . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
`
`Chapter 3
`
`Low-Throughput (LT) Protocol . . . . . . . . . . . . . . . . .33
`
`Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
`Sample Prep Workflow. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
`Fragment DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
`Perform End Repair . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
`Adenylate 3' Ends. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
`
`TruSeq DNA Sample Preparation Guide
`
`vii
`
`00007
`
`

`

`Ligate Adapters . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .45
`Purify Ligation Products . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .51
`Enrich DNA Fragments . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .55
`Validate Library . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .59
`Pool Libraries . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .61
`
`Chapter 4 High-Throughput (HT) Protocol . . . . . . . . . . . . . . . . 65
`
`Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .66
`Sample Prep Workflow . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .67
`Fragment DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .68
`Perform End Repair . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .71
`Adenylate 3' Ends . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .75
`Ligate Adapters . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .77
`Purify Ligation Products . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .83
`Enrich DNA Fragments . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .87
`Validate Library . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .92
`Pool Libraries . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .94
`
`Technical Assistance . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 99
`
`Table of Contents
`
`viii
`
`Part # 15005180 Rev. A
`
`00008
`
`

`

`List of Tables
`
`Table 1
`Table 2
`Table 3
`Table 4
`Table 5
`Table 6
`Table 7
`Table 8
`Table 9
`Table 10
`Table 11
`Table 12
`Table 13
`
`Protocol Features . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
`TruSeq DNA Sample Preparation Acronyms . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
`In-Line Control Functions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
`Sample Sheet Fields. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
`User-Supplied Consumables . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
`User-Supplied Consumables - Additional Items for LT Processing. . . . . . 31
`User-Supplied Consumables - Additional Items for HT Processing . . . . . 32
`User-Supplied Equipment . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
`User-Supplied Equipment - Additional Items for HT Processing. . . . . . . . 32
`Pooled Sample Volumes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63
`Pooled Sample Volumes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96
`Illumina General Contact Information. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 99
`Illumina Customer Support Telephone Numbers . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 99
`
`TruSeq DNA Sample Preparation Guide
`
`ix
`
`00009
`
`

`

`x
`
`Part # 15005180 Rev. A
`
`List of Tables
`
`00010
`
`

`

`Chapter 1
`
`Overview
`
`Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
`Audience and Purpose. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
`
`TruSeq DNA Sample Preparation Guide
`
`11
`
`00011
`
`

`

`Introduction
`
`This(cid:561)protocol(cid:561)explains(cid:561)how(cid:561)to(cid:561)prepare(cid:561)12(cid:561)pooled(cid:561)indexed(cid:561)paired(cid:556)end(cid:561)libraries(cid:561)of(cid:561)genomic(cid:561)
`DNA(cid:561)(gDNA)(cid:561)for(cid:561)subsequent(cid:561)cluster(cid:561)generation(cid:561)and(cid:561)DNA(cid:561)sequencing(cid:561)using(cid:561)the(cid:561)reagents(cid:561)
`provided(cid:561)in(cid:561)the(cid:561)Illumina(cid:561)® TruSeq™(cid:561)DNA(cid:561)Sample(cid:561)Preparation(cid:561)Kit.(cid:561)The(cid:561)goal(cid:561)of(cid:561)this(cid:561)
`protocol(cid:561)is(cid:561)to(cid:561)add(cid:561)adapter(cid:561)sequences(cid:561)onto(cid:561)the(cid:561)ends(cid:561)of(cid:561)DNA(cid:561)fragments(cid:561)to(cid:561)generate(cid:561)
`multiplexed(cid:561)single(cid:561)read(cid:561)or(cid:561)paired(cid:561)end(cid:561)sequencing(cid:561)libraries.
`The(cid:561)sample(cid:561)preparation(cid:561)protocol(cid:561)offers:
`Streamlined(cid:561)Workflow
`(cid:96) Master(cid:556)mixed(cid:561)reagents(cid:561)to(cid:561)reduce(cid:561)reagent(cid:561)containers,(cid:561)pipetting(cid:561)and(cid:561)hands(cid:556)on(cid:561)time
`(cid:96) Universal(cid:561)adapter(cid:561)for(cid:561)preparation(cid:561)of(cid:561)SR,(cid:561)PE,(cid:561)and(cid:561)Multiplexing
`Higher(cid:561)Throughput
`(cid:96) Simultaneous(cid:561)preparation(cid:561)of(cid:561)96(cid:561)multiplexed(cid:561)DNA(cid:561)samples
`(cid:96) Volumes(cid:561)optimized(cid:561)for(cid:561)standard(cid:561)96(cid:556)well(cid:561)plate
`Improved(cid:561)Troubleshooting
`(cid:96) Process(cid:561)control(cid:561)checks(cid:561)built(cid:556)in(cid:561)for(cid:561)QC
`Universal(cid:561)index(cid:561)adapter(cid:561)tags(cid:561)all(cid:561)samples
`(cid:96) Additional(cid:561)adapters(cid:561)and(cid:561)primers(cid:561)not(cid:561)necessary
`(cid:96) Enables(cid:561)multiplexing(cid:561)earlier(cid:561)in(cid:561)the(cid:561)process
`The(cid:561)protocol(cid:561)is(cid:561)compatible(cid:561)with(cid:561)no(cid:561)indexing(cid:561)or(cid:561)a(cid:561)lower(cid:561)indexing(cid:561)pooling(cid:561)level.(cid:561)The(cid:561)
`libraries(cid:561)generated(cid:561)do(cid:561)not(cid:561)require(cid:561)PCR(cid:561)amplification(cid:561)to(cid:561)enable(cid:561)cluster(cid:561)generation,(cid:561)
`although(cid:561)PCR(cid:561)is(cid:561)recommended(cid:561)in(cid:561)the(cid:561)standard(cid:561)protocol(cid:561)to(cid:561)robustly(cid:561)meet(cid:561)the(cid:561)yield(cid:561)
`requirements(cid:561)of(cid:561)most(cid:561)standard(cid:561)applications.
`
`Figure(cid:561)1(cid:561)(cid:561)(cid:561)Sequencing(cid:561)Library(cid:561)After(cid:561)TruSeq(cid:561)DNA(cid:561)Sample(cid:561)Preparation
`
`Overview
`
`12
`
`Part # 15005180 Rev. A
`
`00012
`
`

`

`Audience and Purpose
`
`This(cid:561)guide(cid:561)documents(cid:561)the(cid:561)sample(cid:561)preparation(cid:561)protocol(cid:561)using(cid:561)the(cid:561)Illumina TruSeq(cid:561)DNA(cid:561)
`Sample(cid:561)Preparation(cid:561)Kit.(cid:561)
`(cid:96) Chapter(cid:561)3,(cid:561)explains(cid:561)how(cid:561)to(cid:561)perform(cid:561)the(cid:561)TruSeq(cid:561)DNA(cid:561)Sample(cid:561)Preparation(cid:561)using(cid:561)the(cid:561)
`TruSeq(cid:561)DNA(cid:561)Sample(cid:561)Preparation(cid:561)Low(cid:561)Throughput(cid:561)(LT)(cid:561)Protocol
`(cid:96) Chapter(cid:561)4,(cid:561)explains(cid:561)how(cid:561)to(cid:561)perform(cid:561)the(cid:561)TruSeq(cid:561)DNA(cid:561)Sample(cid:561)Preparation(cid:561)using(cid:561)the(cid:561)
`TruSeq(cid:561)DNA(cid:561)Sample(cid:561)Preparation(cid:561)High(cid:561)Throughput(cid:561)(HT)(cid:561)Protocol
`Equivalent(cid:561)results(cid:561)can(cid:561)be(cid:561)expected(cid:561)from(cid:561)either(cid:561)protocol(cid:561)and(cid:561)their(cid:561)distinguishing(cid:561)elements(cid:561)
`are(cid:561)as(cid:561)follows:
`
`Table(cid:561)1(cid:561)(cid:561)(cid:561)Protocol(cid:561)Features
`
`Low(cid:561)Throughput
`
`High(cid:561)Throughput
`
`Number(cid:561)of(cid:561)Samples(cid:561)
`Processed
`
`48(cid:561)or(cid:561)fewer
`with(cid:561)indexed(cid:561)adapters
`
`More(cid:561)than(cid:561)48
`with(cid:561)indexed(cid:561)adapters
`
`Plate(cid:561)Type
`
`96(cid:556)well(cid:561)0.3(cid:561)ml(cid:561)PCR(cid:3)
`96(cid:556)well(cid:561)MIDI
`
`96(cid:556)well(cid:561)TCY
`96(cid:556)well(cid:561)MIDI
`
`Incubation(cid:561)Equipment
`
`96(cid:556)well(cid:561)thermal(cid:561)cycler
`
`Microheating(cid:561)system
`
`Mixing(cid:561)Method
`
`Pipetting
`
`Micro(cid:561)plate(cid:561)shaker
`
`TruSeq DNA Sample Preparation Guide
`
`13
`
`00013
`
`

`

`14
`
`Part # 15005180 Rev. A
`
`Overview
`
`00014
`
`

`

`Chapter 2
`
`Standard Operating
`Procedures
`
`Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
`Acronyms . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
`Best Practices . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
`DNA Input Recommendations . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
`In-Line Control DNA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
`Tracking Tools . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
`Kit Contents . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
`Consumables and Equipment . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
`
`TruSeq DNA Sample Preparation Guide
`
`15
`
`00015
`
`

`

`Introduction
`
`This(cid:561)chapter(cid:561)explains(cid:561)standard(cid:561)operating(cid:561)procedures(cid:561)and(cid:561)precautions(cid:561)for(cid:561)performing(cid:561)the(cid:561)
`TruSeq(cid:561)DNA(cid:561)Sample(cid:561)Preparation.(cid:561)You(cid:561)will(cid:561)also(cid:561)find(cid:561)lists(cid:561)of(cid:561)standard(cid:561)equipment(cid:561)and(cid:561)
`consumables.
`The(cid:561)sample(cid:561)preparation(cid:561)protocols(cid:561)described(cid:561)in(cid:561)the(cid:561)rest(cid:561)of(cid:561)this(cid:561)guide(cid:561)assume(cid:561)that(cid:561)you(cid:561)are(cid:561)
`familiar(cid:561)with(cid:561)the(cid:561)contents(cid:561)of(cid:561)this(cid:561)chapter,(cid:561)have(cid:561)implemented(cid:561)all(cid:561)the(cid:561)recommendations,(cid:561)
`and(cid:561)have(cid:561)obtained(cid:561)all(cid:561)of(cid:561)the(cid:561)requisite(cid:561)equipment(cid:561)and(cid:561)consumables.
`
`Standard Operating Procedures
`
`16
`
`Part # 15005180 Rev. A
`
`00016
`
`

`

`Acronyms
`
`Table(cid:561)2(cid:561)(cid:561)(cid:561)TruSeq(cid:561)DNA(cid:561)Sample(cid:561)Preparation(cid:561)Acronyms(cid:561)
`
`Acronym
`
`Definition
`
`ALP
`
`ATL
`
`CAP
`
`CFP
`
`CPP
`
`CTA
`
`CTE
`
`CTL
`
`DCT
`
`Adapter(cid:561)Ligation(cid:561)Plate
`
`A(cid:556)Tailing(cid:561)Mix
`
`Clean(cid:561)Up(cid:561)ALP(cid:561)Plate
`
`Covaris(cid:561)Fragmentation(cid:561)Plate
`
`Clean(cid:561)Up(cid:561)PCR(cid:561)Plate
`
`A(cid:556)Tailing(cid:561)Control
`
`End(cid:561)Repair(cid:561)Control
`
`Ligase(cid:561)Control(cid:561)
`
`Diluted(cid:561)Cluster(cid:561)Template
`
`dsDNA
`
`double(cid:556)stranded(cid:561)DNA
`
`ERP
`
`EUC
`
`End(cid:561)Repair(cid:561)Mix
`
`Experienced(cid:561)User(cid:561)Card
`
`gDNA
`
`genomic(cid:561)DNA
`
`HT
`
`IMP
`
`ISP
`
`LIG
`
`LT
`
`LTF
`
`High(cid:561)Throughput
`
`Insert(cid:561)Modification(cid:561)Plate
`
`Intermediate(cid:561)Source(cid:561)Plate
`
`DNA(cid:561)Ligation(cid:561)Mix
`
`Low(cid:561)Throughput
`
`Lab(cid:561)Tracking(cid:561)Form
`
`TruSeq DNA Sample Preparation Guide
`
`17
`
`00017
`
`

`

`Table(cid:561)2(cid:561)(cid:561)(cid:561)TruSeq(cid:561)DNA(cid:561)Sample(cid:561)Preparation(cid:561)Acronyms(cid:561)(Continued)
`
`Acronym
`
`Definition
`
`PCR
`
`PDP
`
`PMM
`
`PPC
`
`RSB
`
`SSP
`
`STL
`
`TSP
`
`Polymerase(cid:561)Chain(cid:561)Reaction
`
`Pooled(cid:561)Dilution(cid:561)Plate
`
`PCR(cid:561)Master(cid:561)Mix
`
`PCR(cid:561)Primer(cid:561)Cocktail
`
`Resuspension(cid:561)Buffer
`
`Size(cid:561)Separate(cid:561)Plate
`
`Stop(cid:561)Ligase(cid:561)Mix
`
`Target(cid:561)Sample(cid:561)Plate
`
`Standard Operating Procedures
`
`18
`
`Part # 15005180 Rev. A
`
`00018
`
`

`

`Best Practices
`
`When(cid:561)preparing(cid:561)gDNA(cid:561)libraries(cid:561)for(cid:561)sequencing,(cid:561)you(cid:561)should(cid:561)always(cid:561)adhere(cid:561)to(cid:561)good(cid:561)
`molecular(cid:561)biology(cid:561)practices.
`
`Liquid Handling
`Good(cid:561)liquid(cid:561)handling(cid:561)measures(cid:561)are(cid:561)essential,(cid:561)particularly(cid:561)when(cid:561)quantifying(cid:561)libraries(cid:561)or(cid:561)
`diluting(cid:561)concentrated(cid:561)libraries(cid:561)for(cid:561)making(cid:561)clusters.
`(cid:96) Small(cid:561)differences(cid:561)in(cid:561)volumes(cid:561)(±0.5(cid:561)(cid:912)l)(cid:561)can(cid:561)sometimes(cid:561)give(cid:561)rise(cid:561)to(cid:561)very(cid:561)large(cid:561)
`differences(cid:561)in(cid:561)cluster(cid:561)numbers(cid:561)(~100,000).
`(cid:96) Small(cid:561)volume(cid:561)pipetting(cid:561)can(cid:561)be(cid:561)a(cid:561)source(cid:561)of(cid:561)potential(cid:561)error(cid:561)in(cid:561)protocols(cid:561)that(cid:561)require(cid:561)
`generation(cid:561)of(cid:561)standard(cid:561)curves,(cid:561)such(cid:561)as(cid:561)PicoGreen(cid:561)assays(cid:561)or(cid:561)qPCR,(cid:561)or(cid:561)those(cid:561)that(cid:561)
`require(cid:561)small(cid:561)but(cid:561)precise(cid:561)volumes,(cid:561)such(cid:561)as(cid:561)the(cid:561)Agilent(cid:561)BioAnalyzer.
`(cid:96) If(cid:561)small(cid:561)volumes(cid:561)are(cid:561)unavoidable,(cid:561)then(cid:561)due(cid:561)diligence(cid:561)should(cid:561)be(cid:561)taken(cid:561)to(cid:561)ensure(cid:561)that(cid:561)
`pipettes(cid:561)are(cid:561)correctly(cid:561)calibrated.
`(cid:96) Ensure(cid:561)that(cid:561)pipettes(cid:561)are(cid:561)not(cid:561)used(cid:561)at(cid:561)the(cid:561)volume(cid:561)extremes(cid:561)of(cid:561)their(cid:561)performance(cid:561)
`specifications.
`(cid:96) Care(cid:561)should(cid:561)be(cid:561)taken,(cid:561)because(cid:561)solutions(cid:561)of(cid:561)high(cid:561)molecular(cid:561)weight(cid:561)double(cid:556)stranded(cid:561)
`(ds)DNA(cid:561)can(cid:561)be(cid:561)viscous(cid:561)and(cid:561)not(cid:561)evenly(cid:561)dispersed,(cid:561)resulting(cid:561)in(cid:561)aliquot(cid:561)measurements(cid:561)
`that(cid:561)are(cid:561)not(cid:561)representative(cid:561)of(cid:561)the(cid:561)true(cid:561)concentration(cid:561)of(cid:561)the(cid:561)solution.
`
`AMPure XP Handling
`The(cid:561)following(cid:561)indicates(cid:561)the(cid:561)appropriate(cid:561)handling(cid:561)methods(cid:561)when(cid:561)working(cid:561)with(cid:561)
`Agencourt(cid:561)AMPure(cid:561)XP(cid:561)Beads:
`(cid:96) Prior(cid:561)to(cid:561)use,(cid:561)allow(cid:561)the(cid:561)beads(cid:561)to(cid:561)come(cid:561)to(cid:561)room(cid:561)temperature.
`(cid:96) Immediately(cid:561)prior(cid:561)to(cid:561)use,(cid:561)vortex(cid:561)the(cid:561)beads(cid:561)until(cid:561)they(cid:561)are(cid:561)well(cid:561)dispersed.(cid:561)The(cid:561)color(cid:561)of(cid:561)
`the(cid:561)liquid(cid:561)should(cid:561)appear(cid:561)homogeneous.
`(cid:96) When(cid:561)performing(cid:561)the(cid:561)LT(cid:561)protocol,(cid:561)after(cid:561)adding(cid:561)the(cid:561)beads(cid:561)to(cid:561)the(cid:561)reaction,(cid:561)mix(cid:561)the(cid:561)
`solution(cid:561)thoroughly(cid:561)by(cid:561)pipetting(cid:561)up(cid:561)and(cid:561)down(cid:561)10(cid:561)times.(cid:561)
`(cid:96) When(cid:561)performing(cid:561)the(cid:561)HT(cid:561)protocol,(cid:561)after(cid:561)adding(cid:561)the(cid:561)beads(cid:561)to(cid:561)the(cid:561)reaction,(cid:561)seal(cid:561)the(cid:561)
`plate(cid:561)and(cid:561)shake(cid:561)the(cid:561)plate(cid:561)on(cid:561)a(cid:561)microplate(cid:561)shaker(cid:561)at(cid:561)1,800(cid:561)rpm(cid:561)for(cid:561)2(cid:561)minutes.(cid:561)Repeat,(cid:561)if(cid:561)
`necessary,(cid:561)until(cid:561)the(cid:561)color(cid:561)of(cid:561)the(cid:561)mixture(cid:561)appears(cid:561)homogeneous(cid:561)after(cid:561)mixing.
`(cid:96) Change(cid:561)the(cid:561)tips(cid:561)for(cid:561)each(cid:561)sample(cid:561)or(cid:561)when(cid:561)using(cid:561)a(cid:561)multichannel(cid:561)pipette,(cid:561)change(cid:561)the(cid:561)
`tips(cid:561)after(cid:561)each(cid:561)column.
`
`TruSeq DNA Sample Preparation Guide
`
`19
`
`00019
`
`

`

`(cid:96) Let(cid:561)the(cid:561)mixed(cid:561)samples(cid:561)incubate(cid:561)for(cid:561)15(cid:561)minutes(cid:561)at(cid:561)room(cid:561)temperature(cid:561)for(cid:561)maximum(cid:561)
`recovery.
`(cid:96) When(cid:561)aspirating(cid:561)the(cid:561)cleared(cid:561)solution(cid:561)from(cid:561)the(cid:561)reaction(cid:561)plate(cid:561)and(cid:561)wash(cid:561)step,(cid:561)it(cid:561)is(cid:561)
`important(cid:561)to(cid:561)keep(cid:561)the(cid:561)plate(cid:561)on(cid:561)the(cid:561)magnetic(cid:561)stand(cid:561)and(cid:561)to(cid:561)not(cid:561)disturb(cid:561)the(cid:561)separated(cid:561)
`magnetic(cid:561)beads.(cid:561)Aspirate(cid:561)slowly(cid:561)to(cid:561)prevent(cid:561)the(cid:561)beads(cid:561)from(cid:561)sliding(cid:561)down(cid:561)the(cid:561)sides(cid:561)of(cid:561)
`the(cid:561)wells(cid:561)and(cid:561)into(cid:561)the(cid:561)pipette(cid:561)tips.
`(cid:96) For(cid:561)the(cid:561)wash(cid:561)steps,(cid:561)prepare(cid:561)fresh(cid:561)80%(cid:561)ethanol.(cid:561)Eighty(cid:556)percent(cid:561)ethanol(cid:561)tends(cid:561)to(cid:561)absorb(cid:561)
`water(cid:561)from(cid:561)the(cid:561)air,(cid:561)therefore,(cid:561)fresh(cid:561)80%(cid:561)ethanol(cid:561)should(cid:561)be(cid:561)prepared(cid:561)for(cid:561)optimal(cid:561)
`results.
`(cid:96) Be(cid:561)sure(cid:561)to(cid:561)remove(cid:561)all(cid:561)of(cid:561)the(cid:561)ethanol(cid:561)from(cid:561)the(cid:561)bottom(cid:561)of(cid:561)the(cid:561)wells,(cid:561)as(cid:561)it(cid:561)may(cid:561)contain(cid:561)
`residual(cid:561)contaminants.
`(cid:96) Remove(cid:561)the(cid:561)reaction(cid:561)plate(cid:561)from(cid:561)the(cid:561)magnetic(cid:561)stand(cid:561)and(cid:561)let(cid:561)it(cid:561)air(cid:556)dry(cid:561)at(cid:561)room(cid:561)
`temperature.(cid:561)Allow(cid:561)for(cid:561)the(cid:561)complete(cid:561)evaporation(cid:561)of(cid:561)residual(cid:561)ethanol,(cid:561)as(cid:561)it(cid:561)impacts(cid:561)the(cid:561)
`performance(cid:561)of(cid:561)the(cid:561)subsequent(cid:561)reactions.(cid:561)Illumina(cid:561)recommends(cid:561)at(cid:561)least(cid:561)15(cid:561)minutes(cid:561)
`drying(cid:561)time,(cid:561)but(cid:561)a(cid:561)longer(cid:561)drying(cid:561)time(cid:561)may(cid:561)be(cid:561)required.
`(cid:96) Use(cid:561)the(cid:561)Resuspension(cid:561)Buffer(cid:561)for(cid:561)DNA(cid:561)elution.
`• When(cid:561)performing(cid:561)the(cid:561)LT(cid:561)protocol,(cid:561)gently(cid:561)pipette(cid:561)up(cid:561)and(cid:561)down(cid:561)10(cid:561)times(cid:561)making(cid:561)
`sure(cid:561)the(cid:561)liquid(cid:561)comes(cid:561)in(cid:561)contact(cid:561)with(cid:561)the(cid:561)beads(cid:561)and(cid:561)that(cid:561)the(cid:561)beads(cid:561)are(cid:561)
`resuspended(cid:561)homogeneously.(cid:561)
`• When(cid:561)performing(cid:561)the(cid:561)HT(cid:561)protocol,(cid:561)seal(cid:561)the(cid:561)plate(cid:561)and(cid:561)shake(cid:561)the(cid:561)plate(cid:561)on(cid:561)a(cid:561)
`microplate(cid:561)shaker(cid:561)at(cid:561)1,800(cid:561)rpm(cid:561)for(cid:561)2(cid:561)minutes,(cid:561)
`
`Avoid Cross-Contamination
`(cid:96) Open(cid:561)only(cid:561)one(cid:561)adapter(cid:561)at(cid:561)the(cid:561)time.
`(cid:96) Pipette(cid:561)carefully(cid:561)to(cid:561)avoid(cid:561)spillage.
`(cid:96) Clean(cid:561)pipettes(cid:561)and(cid:561)change(cid:561)gloves(cid:561)between(cid:561)handling(cid:561)different(cid:561)adapter(cid:561)stocks.
`(cid:96) Clean(cid:561)work(cid:561)surfaces(cid:561)thoroughly(cid:561)before(cid:561)and(cid:561)after(cid:561)the(cid:561)procedure.
`
`Standard Operating Procedures
`
`20
`
`Part # 15005180 Rev. A
`
`00020
`
`

`

`Potential DNA Contaminants
`Incorrect(cid:561)DNA(cid:561)quantitation(cid:561)may(cid:561)result(cid:561)from(cid:561)DNA(cid:561)contamination,(cid:561)for(cid:561)example,(cid:561)by(cid:561)
`interference(cid:561)from(cid:561)superfluous(cid:561)nucleic(cid:561)acids(cid:561)in(cid:561)a(cid:561)sample(cid:561)(e.g.,(cid:561)RNA,(cid:561)small(cid:561)nucleic(cid:561)acid(cid:561)
`fragments,(cid:561)nucleotides,(cid:561)single(cid:556)stranded(cid:561)DNA),(cid:561)excess(cid:561)proteins,(cid:561)or(cid:561)other(cid:561)contaminating(cid:561)
`materials.(cid:561)DNA(cid:561)quality(cid:561)may(cid:561)also(cid:561)affect(cid:561)the(cid:561)quantity(cid:561)of(cid:561)usable(cid:561)DNA(cid:561)in(cid:561)a(cid:561)sample.(cid:561)For(cid:561)
`example,(cid:561)if(cid:561)the(cid:561)DNA(cid:561)is(cid:561)damaged(cid:561)(e.g.,(cid:561)heavily(cid:561)nicked(cid:561)or(cid:561)containing(cid:561)extensive(cid:561)apurinic/
`apyrimidinic(cid:561)sites),(cid:561)then(cid:561)many(cid:561)of(cid:561)these(cid:561)fragments(cid:561)may(cid:561)fail(cid:561)during(cid:561)library(cid:561)preparation.(cid:561)
`High(cid:561)molecular(cid:561)weight(cid:561)dsDNA(cid:561)derived(cid:561)from(cid:561)host(cid:561)genomes(cid:561)can(cid:561)also(cid:561)interfere(cid:561)with(cid:561)
`accurate(cid:561)quantitation.(cid:561)For(cid:561)example,(cid:561)bacterial(cid:561)artificial(cid:561)chromosomes(cid:561)(BACs)(cid:561)and(cid:561)other(cid:561)
`bacterially(cid:556)derived(cid:561)plasmids(cid:561)usually(cid:561)contain(cid:561)a(cid:561)small(cid:561)percentage(cid:561)of(cid:561)the(cid:561)chromosomal(cid:561)
`DNA(cid:561)from(cid:561)the(cid:561)host(cid:561)cells,(cid:561)despite(cid:561)the(cid:561)best(cid:561)purification(cid:561)efforts.(cid:561)These(cid:561)sequences(cid:561)may(cid:561)
`ultimately(cid:561)give(cid:561)rise(cid:561)to(cid:561)unwanted(cid:561)clusters(cid:561)on(cid:561)a(cid:561)flow(cid:561)cell(cid:561)lane.(cid:561)However,(cid:561)this(cid:561)contamination(cid:561)
`can(cid:561)be(cid:561)accurately(cid:561)quantified(cid:561)by(cid:561)analyzing(cid:561)aligned(cid:561)reads(cid:561)generated(cid:561)during(cid:561)sequencing(cid:561)
`against(cid:561)known(cid:561)bacterial(cid:561)sequences(cid:561)and(cid:561)subtracting(cid:561)these(cid:561)out.(cid:561)High(cid:561)molecular(cid:561)weight(cid:561)
`contamination(cid:561)may(cid:561)also(cid:561)be(cid:561)estimated(cid:561)prior(cid:561)to(cid:561)library(cid:561)preparation(cid:561)using(cid:561)qPCR(cid:561)assays(cid:561)
`designed(cid:561)to(cid:561)target(cid:561)unique(cid:561)chromosomal(cid:561)markers.
`
`Temperature Considerations
`Temperature(cid:561)is(cid:561)another(cid:561)important(cid:561)consideration(cid:561)for(cid:561)making(cid:561)gDNA(cid:561)libraries.(cid:561)Elevated(cid:561)
`temperatures(cid:561)should(cid:561)be(cid:561)particularly(cid:561)avoided(cid:561)in(cid:561)the(cid:561)steps(cid:561)preceding(cid:561)the(cid:561)adapter(cid:561)ligation.(cid:561)
`DNA(cid:561)fragments(cid:561)that(cid:561)have(cid:561)a(cid:561)high(cid:561)AT(cid:561)content(cid:561)are(cid:561)more(cid:561)likely(cid:561)to(cid:561)denature(cid:561)into(cid:561)single(cid:561)
`strands(cid:561)than(cid:561)GC(cid:556)rich(cid:561)fragments,(cid:561)which(cid:561)can(cid:561)result(cid:561)in(cid:561)an(cid:561)increased(cid:561)probability(cid:561)of(cid:561)creating(cid:561)a(cid:561)
`bias(cid:561)in(cid:561)the(cid:561)sequencing(cid:561)coverage.(cid:561)As(cid:561)a(cid:561)general(cid:561)rule,(cid:561)libraries(cid:561)should(cid:561)be(cid:561)kept(cid:561)at(cid:561)
`temperatures(cid:561)<37°C.(cid:561)Temperature(cid:561)is(cid:561)less(cid:561)of(cid:561)an(cid:561)issue(cid:561)after(cid:561)the(cid:561)adapters(cid:561)have(cid:561)been(cid:561)ligated(cid:561)
`onto(cid:561)the(cid:561)ends(cid:561)of(cid:561)the(cid:561)DNA,(cid:561)although(cid:561)care(cid:561)should(cid:561)be(cid:561)taken(cid:561)not(cid:561)to(cid:561)denature(cid:561)the(cid:561)library(cid:561)prior(cid:561)
`to(cid:561)the(cid:561)agarose(cid:561)gel(cid:561)electrophoresis(cid:561)process,(cid:561)because(cid:561)single(cid:556)stranded(cid:561)DNA(cid:561)has(cid:561)a(cid:561)different(cid:561)
`migration(cid:561)rate.
`
`TruSeq DNA Sample Preparation Guide
`
`21
`
`00021
`
`

`

`DNA Input Recommendations
`
`Input DNA Quantitation
`This(cid:561)protocol(cid:561)is(cid:561)optimized(cid:561)for(cid:561)1(cid:561)(cid:912)g(cid:561)input(cid:561)DNA.(cid:561)The(cid:561)ultimate(cid:561)success(cid:561)or(cid:561)failure(cid:561)of(cid:561)a(cid:561)library(cid:561)
`preparation(cid:561)strongly(cid:561)depends(cid:561)on(cid:561)using(cid:561)an(cid:561)accurately(cid:561)quantified(cid:561)amount(cid:561)of(cid:561)input(cid:561)DNA.(cid:561)
`Therefore,(cid:561)the(cid:561)correct(cid:561)quantitation(cid:561)of(cid:561)gDNA(cid:561)is(cid:561)essential.
`Illumina(cid:561)strongly(cid:561)recommends(cid:561)quantifying(cid:561)the(cid:561)starting(cid:561)genomic(cid:561)material(cid:561)by(cid:561)a(cid:561)
`fluorescence(cid:556)based(cid:561)quantification,(cid:561)rather(cid:561)than(cid:561)a(cid:561)UV(cid:556)spectrometer(cid:556)based(cid:561)method.(cid:561)This(cid:561)is(cid:561)
`because(cid:561)fluorescence(cid:556)based(cid:561)methods,(cid:561)which(cid:561)employ(cid:561)a(cid:561)double(cid:556)stranded(cid:561)(ds)(cid:561)DNA(cid:561)specific(cid:561)
`dye,(cid:561)will(cid:561)specifically(cid:561)and(cid:561)accurately(cid:561)quantitate(cid:561)dsDNA(cid:561)even(cid:561)in(cid:561)the(cid:561)presence(cid:561)of(cid:561)many(cid:561)
`common(cid:561)contaminants.(cid:561)UV(cid:561)spectrometer(cid:561)methods(cid:561)based(cid:561)on(cid:561)260(cid:561)OD(cid:561)readings(cid:561)are(cid:561)prone(cid:561)to(cid:561)
`overestimating(cid:561)the(cid:561)DNA(cid:561)concentration(cid:561)due(cid:561)to(cid:561)the(cid:561)pr