`
`(cid:36)(cid:37)(cid:19)(cid:25)(cid:1)(cid:68)(cid:80)(cid:84)(cid:85)(cid:74)(cid:78)(cid:86)(cid:77)(cid:66)(cid:85)(cid:74)(cid:80)(cid:79)(cid:1)(cid:74)(cid:78)(cid:81)(cid:83)(cid:80)(cid:87)(cid:70)(cid:84)(cid:1)(cid:70)(cid:89)(cid:81)(cid:66)(cid:79)(cid:84)(cid:74)(cid:80)(cid:79)(cid:1)(cid:66)(cid:79)(cid:69)(cid:1)
`(cid:81)(cid:70)(cid:83)(cid:84)(cid:74)(cid:84)(cid:85)(cid:70)(cid:79)(cid:68)(cid:70)(cid:1)(cid:80)(cid:71)(cid:1)(cid:68)(cid:73)(cid:74)(cid:78)(cid:70)(cid:83)(cid:74)(cid:68)(cid:1)(cid:66)(cid:79)(cid:85)(cid:74)(cid:72)(cid:70)(cid:79)(cid:1)(cid:83)(cid:70)(cid:68)(cid:70)(cid:81)(cid:85)(cid:80)(cid:83)(cid:109)
`(cid:78)(cid:80)(cid:69)(cid:74)(cid:71)(cid:74)(cid:70)(cid:69)(cid:1)(cid:53)(cid:1)(cid:68)(cid:70)(cid:77)(cid:77)(cid:84)(cid:1)(cid:74)(cid:79)(cid:1)(cid:77)(cid:90)(cid:78)(cid:81)(cid:73)(cid:80)(cid:78)(cid:66)(cid:1)(cid:81)(cid:66)(cid:85)(cid:74)(cid:70)(cid:79)(cid:85)(cid:84)
`
`Barbara Savoldo,1,2 Carlos Almeida Ramos,1,3,4 Enli Liu,1 Martha P. Mims,3
`Michael J. Keating,5 George Carrum,1,4 Rammurti T. Kamble,1,4 Catherine M. Bollard,1,3,4
`Adrian P. Gee,1 Zhuyong Mei,1 Hao Liu,6 Bambi Grilley,1,2 Cliona M. Rooney,1,2,7,8
`Helen E. Heslop,1,2,3,4 Malcolm K. Brenner,1,2,3,4 and Gianpietro Dotti1,3,8
`
`1Center for Cell and Gene Therapy, Baylor College of Medicine, Houston, Texas, USA. 2Department of Pediatrics, Texas Children’s Hospital,
`Houston, Texas, USA. 3Department of Medicine, Baylor College of Medicine, Houston, Texas, USA. 4The Methodist Hospital, Houston, Texas, USA.
`5The University of Texas MD Anderson Cancer Center, Houston, Texas, USA. 6Biostatistics Core of the Dan L. Duncan Cancer Center,
`Houston, Texas, USA. 7Department of Virology and 8Department of Immunology, Baylor College of Medicine, Houston, Texas, USA.
`
`Targeted T cell immunotherapies using engineered T lymphocytes expressing tumor-directed chimeric anti-
`gen receptors (CARs) are designed to benefit patients with cancer. Although incorporation of costimula-
`tory endodomains within these CARs increases the proliferation of CAR-redirected T lymphocytes, it has
`proven difficult to draw definitive conclusions about the specific effects of costimulatory endodomains on
`the expansion, persistence, and antitumor effectiveness of CAR-redirected T cells in human subjects, owing
`to the lack of side-by-side comparisons with T cells bearing only a single signaling domain. We therefore
`designed a study that allowed us to directly measure the consequences of adding a costimulatory endodomain
`to CAR-redirected T cells. Patients with B cell lymphomas were simultaneously infused with 2 autologous T
`cell products expressing CARs with the same specificity for the CD19 antigen, present on most B cell malig-
`nancies. One CAR encoded both the costimulatory CD28 and the ζ-endodomains, while the other encoded
`only the ζ-endodomain. CAR+ T cells containing the CD28 endodomain showed strikingly enhanced expan-
`sion and persistence compared with CAR+ T cells lacking this endodomain. These results demonstrate the
`superiority of CARs with dual signal domains and confirm a method of comparing CAR-modified T cells
`within individual patients, thereby avoiding patient-to-patient variability and accelerating the development
`of optimal T cell immunotherapies.
`
`(cid:42)(cid:79)(cid:85)(cid:83)(cid:80)(cid:69)(cid:86)(cid:68)(cid:85)(cid:74)(cid:80)(cid:79)
`As T cell immunotherapy extends into clinical application (1, 2),
`its benefits are being expanded by engineering T lymphocytes
`to express chimeric antigen receptors (CARs) that recognize
`specific antigens expressed on the cell surface of different
`types of tumor cells (3–8). CAR molecules usually combine the
`antigen-binding domain of the variable regions of a specific
`monoclonal antibody (scFv) with the CD3ζ endodomain of the
`TCR/CD3 complex (so-called first-generation CARs) (4). When
`expressed by T lymphocytes, CARs provide potent antigen-spe-
`cific, non-MHC-restricted effector function against tumor cells
`in preclinical models (5). However, in the initial human trials, T
`lymphocytes expressing first-generation CARs showed limited
`expansion and relatively short persistence (3, 9, 10). This result
`likely reflects the failure of artificial CAR molecules to fully acti-
`vate T cells after antigen engagement on tumor cells, especially
`when the tumor cells lack expression of costimulatory molecules
`(such as CD80 and CD86) that are required for sustained T cell
`activation, growth, and survival (11).
`To provide the costimulation lacking in tumor cell targets and
`thereby overcome the above limitations, several groups have incor-
`porated costimulatory endodomains, including CD28 (12), 4-1BB
`(13, 14), or OX40 (15), into CAR molecules (so-called second-
`
`Conflict of interest: The authors have declared that no conflict of interest exists.
`Citation for this article: J Clin Invest. 2011;121(5):1822–1826. doi:10.1172/JCI46110.
`
`generation CARs). Although preclinical studies suggest that this
`strategy can indeed augment the activation of CAR-modified T
`lymphocytes (5, 7, 12), there has been no direct demonstration of
`this effect in human subjects. To meet this challenge, we designed
`a clinical study in which patients with non-Hodgkin lymphomas
`(NHLs) were infused simultaneously with 2 autologous T cell prod-
`ucts, each containing cells that expressed an identical CAR exodo-
`main specific for the CD19 antigen (CD19-specific scFv) (16–18).
`In one product the CAR was coupled to the ζ-endodomain alone
`(CAR.CD19ζ), while in the second product the CAR was coupled
`to both the CD28 and ζ-endodomains (CAR.CD19-28ζ). With this
`study design, each patient acted as a “self-control,” allowing us to
`directly determine in vivo the effects of incorporating a costimula-
`tory endodomain on the fate of the CAR-engineered T cells.
`
`(cid:51)(cid:70)(cid:84)(cid:86)(cid:77)(cid:85)(cid:84)(cid:1)(cid:66)(cid:79)(cid:69)(cid:1)(cid:37)(cid:74)(cid:84)(cid:68)(cid:86)(cid:84)(cid:84)(cid:74)(cid:80)(cid:79)
`We enrolled 6 patients, aged 46 to 59 years, with relapsed or refrac-
`tory NHL (Supplemental Table 1; supplemental material available
`online with this article; doi:10.1172/JCI46110DS1). Each patient
`had active disease, measurable by physical examination or CT or
`PET imaging at the time of the T cell infusions. We generated 2 CAR-
`transduced T cell products for each patient, always from the same
`blood collection. Polyclonal T cell lines were generated after a period
`of culture (mean, 13 days; range, 6–18 days). Products that expressed
`either CAR.CD19ζ or CAR.CD19-28ζ transgenes were similar by
`functional and phenotypic analyses (Figure 1). Two patients were
`
`(cid:18)(cid:25)(cid:19)(cid:19)
`
`The Journal of Clinical Investigation http://www.jci.org Volume 121 Number 5 May 2011
`
`UPenn Ex. 2010
`Miltenyi v. UPenn
`IPR2022-00855
`
`
`
`(cid:67)(cid:83)(cid:74)(cid:70)(cid:71)(cid:1)(cid:83)(cid:70)(cid:81)(cid:80)(cid:83)(cid:85)
`
`(cid:39)(cid:74)(cid:72)(cid:86)(cid:83)(cid:70)(cid:1)(cid:18)
`(cid:53)(cid:83)(cid:66)(cid:79)(cid:84)(cid:69)(cid:86)(cid:68)(cid:85)(cid:74)(cid:80)(cid:79)(cid:1)(cid:70)(cid:71)(cid:71)(cid:74)(cid:68)(cid:74)(cid:70)(cid:79)(cid:68)(cid:90)(cid:1)(cid:66)(cid:79)(cid:69)(cid:1)(cid:81)(cid:73)(cid:70)(cid:79)(cid:80)(cid:85)(cid:90)(cid:81)(cid:74)(cid:68)(cid:16)(cid:71)(cid:86)(cid:79)(cid:68)(cid:85)(cid:74)(cid:80)(cid:79)(cid:1)(cid:81)(cid:83)(cid:80)(cid:71)(cid:74)(cid:77)(cid:70)(cid:1)(cid:80)(cid:71)(cid:1)(cid:53)(cid:1)(cid:68)(cid:70)(cid:77)(cid:77)(cid:1)(cid:77)(cid:74)(cid:79)(cid:70)(cid:84)(cid:15)(cid:1)(cid:9)(cid:34)(cid:10)(cid:1)(cid:39)(cid:34)(cid:36)(cid:52)(cid:1)(cid:66)(cid:79)(cid:69)(cid:1)(cid:50)(cid:14)(cid:49)(cid:36)(cid:51)(cid:1)(cid:66)(cid:79)(cid:66)(cid:77)(cid:90)(cid:84)(cid:70)(cid:84)(cid:1)(cid:84)(cid:73)(cid:80)(cid:88)(cid:74)(cid:79)(cid:72)(cid:1)(cid:85)(cid:83)(cid:66)(cid:79)(cid:84)(cid:69)(cid:86)(cid:68)(cid:85)(cid:74)(cid:80)(cid:79)(cid:1)(cid:70)(cid:71)(cid:71)(cid:74)(cid:68)(cid:74)(cid:70)(cid:79)(cid:68)(cid:90)(cid:1)(cid:88)(cid:74)(cid:85)(cid:73)(cid:1)(cid:36)(cid:34)(cid:51)(cid:15)
`(cid:36)(cid:37)(cid:18)(cid:26)ζ(cid:1)(cid:66)(cid:79)(cid:69)(cid:1)(cid:36)(cid:34)(cid:51)(cid:15)(cid:36)(cid:37)(cid:18)(cid:26)(cid:14)(cid:19)(cid:25)ζ(cid:1)(cid:87)(cid:70)(cid:68)(cid:85)(cid:80)(cid:83)(cid:84)(cid:1)(cid:9)(cid:77)(cid:70)(cid:71)(cid:85)(cid:10)(cid:15)(cid:1)(cid:35)(cid:66)(cid:83)(cid:84)(cid:1)(cid:74)(cid:79)(cid:69)(cid:74)(cid:68)(cid:66)(cid:85)(cid:70)(cid:1)(cid:78)(cid:70)(cid:66)(cid:79)(cid:1)(cid:87)(cid:66)(cid:77)(cid:86)(cid:70)(cid:84)(cid:1)(cid:71)(cid:80)(cid:83)(cid:1)(cid:81)(cid:70)(cid:83)(cid:74)(cid:81)(cid:73)(cid:70)(cid:83)(cid:66)(cid:77)(cid:1)(cid:67)(cid:77)(cid:80)(cid:80)(cid:69)(cid:1)(cid:84)(cid:66)(cid:78)(cid:81)(cid:77)(cid:70)(cid:84)(cid:1)(cid:71)(cid:83)(cid:80)(cid:78)(cid:1)(cid:23)(cid:1)(cid:81)(cid:66)(cid:85)(cid:74)(cid:70)(cid:79)(cid:85)(cid:84)(cid:1)(cid:9)(cid:52)(cid:86)(cid:81)(cid:81)(cid:77)(cid:70)(cid:78)(cid:70)(cid:79)(cid:85)(cid:66)(cid:77)(cid:1)(cid:53)(cid:66)(cid:67)(cid:77)(cid:70)(cid:1)(cid:18)(cid:10)(cid:15)(cid:1)(cid:38)(cid:66)(cid:68)(cid:73)(cid:1)
`(cid:84)(cid:90)(cid:78)(cid:67)(cid:80)(cid:77)(cid:1)(cid:83)(cid:70)(cid:81)(cid:83)(cid:70)(cid:84)(cid:70)(cid:79)(cid:85)(cid:84)(cid:1)(cid:66)(cid:79)(cid:1)(cid:74)(cid:79)(cid:69)(cid:74)(cid:87)(cid:74)(cid:69)(cid:86)(cid:66)(cid:77)(cid:1)(cid:68)(cid:70)(cid:77)(cid:77)(cid:1)(cid:77)(cid:74)(cid:79)(cid:70)(cid:15)(cid:1)(cid:51)(cid:70)(cid:81)(cid:83)(cid:70)(cid:84)(cid:70)(cid:79)(cid:85)(cid:66)(cid:85)(cid:74)(cid:87)(cid:70)(cid:1)(cid:73)(cid:74)(cid:84)(cid:85)(cid:80)(cid:72)(cid:83)(cid:66)(cid:78)(cid:84)(cid:1)(cid:80)(cid:71)(cid:1)(cid:53)(cid:1)(cid:68)(cid:70)(cid:77)(cid:77)(cid:84)(cid:1)(cid:85)(cid:83)(cid:66)(cid:79)(cid:84)(cid:69)(cid:86)(cid:68)(cid:70)(cid:69)(cid:1)(cid:88)(cid:74)(cid:85)(cid:73)(cid:1)(cid:36)(cid:34)(cid:51)(cid:15)(cid:36)(cid:37)(cid:18)(cid:26)ζ(cid:1)(cid:66)(cid:79)(cid:69)(cid:1)(cid:36)(cid:34)(cid:51)(cid:15)(cid:36)(cid:37)(cid:18)(cid:26)(cid:14)(cid:19)(cid:25)ζ(cid:1)(cid:87)(cid:70)(cid:68)(cid:85)(cid:80)(cid:83)(cid:84)(cid:1)(cid:71)(cid:83)(cid:80)(cid:78)(cid:1)
`(cid:81)(cid:66)(cid:85)(cid:74)(cid:70)(cid:79)(cid:85)(cid:84)(cid:1)(cid:79)(cid:86)(cid:78)(cid:67)(cid:70)(cid:83)(cid:1)(cid:18)(cid:1)(cid:66)(cid:79)(cid:69)(cid:1)(cid:79)(cid:86)(cid:78)(cid:67)(cid:70)(cid:83)(cid:1)(cid:22)(cid:1)(cid:66)(cid:83)(cid:70)(cid:1)(cid:66)(cid:77)(cid:84)(cid:80)(cid:1)(cid:81)(cid:83)(cid:70)(cid:84)(cid:70)(cid:79)(cid:85)(cid:70)(cid:69)(cid:1)(cid:9)(cid:83)(cid:74)(cid:72)(cid:73)(cid:85)(cid:10)(cid:15)(cid:1)(cid:47)(cid:86)(cid:78)(cid:67)(cid:70)(cid:83)(cid:84)(cid:1)(cid:83)(cid:70)(cid:81)(cid:83)(cid:70)(cid:84)(cid:70)(cid:79)(cid:85)(cid:1)(cid:85)(cid:73)(cid:70)(cid:1)(cid:81)(cid:70)(cid:83)(cid:68)(cid:70)(cid:79)(cid:85)(cid:66)(cid:72)(cid:70)(cid:1)(cid:80)(cid:71)(cid:1)(cid:36)(cid:34)(cid:51)(cid:12)(cid:1)(cid:68)(cid:70)(cid:77)(cid:77)(cid:84)(cid:15)(cid:1)(cid:9)(cid:35)(cid:10)(cid:1)(cid:51)(cid:70)(cid:84)(cid:86)(cid:77)(cid:85)(cid:84)(cid:1)(cid:80)(cid:71)(cid:1)(cid:66)(cid:1)(cid:21)(cid:14)(cid:73)(cid:80)(cid:86)(cid:83)(cid:1)(cid:22)(cid:18)(cid:36)(cid:83)(cid:14)
`(cid:83)(cid:70)(cid:77)(cid:70)(cid:66)(cid:84)(cid:70)(cid:1)(cid:66)(cid:84)(cid:84)(cid:66)(cid:90)(cid:1)(cid:66)(cid:85)(cid:1)(cid:66)(cid:79)(cid:1)(cid:70)(cid:71)(cid:71)(cid:70)(cid:68)(cid:85)(cid:80)(cid:83)(cid:16)(cid:85)(cid:86)(cid:78)(cid:80)(cid:83)(cid:1)(cid:68)(cid:70)(cid:77)(cid:77)(cid:1)(cid:9)(cid:38)(cid:16)(cid:53)(cid:10)(cid:1)(cid:83)(cid:66)(cid:85)(cid:74)(cid:80)(cid:1)(cid:80)(cid:71)(cid:1)(cid:19)(cid:17)(cid:27)(cid:18)(cid:15)(cid:1)(cid:53)(cid:66)(cid:83)(cid:72)(cid:70)(cid:85)(cid:1)(cid:68)(cid:70)(cid:77)(cid:77)(cid:84)(cid:1)(cid:88)(cid:70)(cid:83)(cid:70)(cid:1)(cid:51)(cid:66)(cid:75)(cid:74)(cid:1)(cid:9)(cid:36)(cid:37)(cid:18)(cid:26)(cid:12)(cid:13)(cid:1)(cid:36)(cid:37)(cid:25)(cid:17)(cid:12)(cid:13)(cid:1)(cid:36)(cid:37)(cid:25)(cid:23)(cid:109)(cid:10)(cid:13)(cid:1)(cid:66)(cid:1)(cid:35)(cid:86)(cid:83)(cid:76)(cid:74)(cid:85)(cid:85)(cid:1)(cid:77)(cid:90)(cid:78)(cid:81)(cid:73)(cid:80)(cid:78)(cid:66)(cid:1)(cid:68)(cid:70)(cid:77)(cid:77)(cid:1)(cid:77)(cid:74)(cid:79)(cid:70)(cid:28)(cid:1)(cid:41)(cid:45)(cid:37)(cid:46)(cid:14)(cid:19)(cid:1)
`(cid:9)(cid:36)(cid:37)(cid:18)(cid:26)(cid:109)(cid:13)(cid:1)(cid:36)(cid:37)(cid:25)(cid:17)(cid:12)(cid:13)(cid:1)(cid:36)(cid:37)(cid:25)(cid:23)(cid:12)(cid:10)(cid:13)(cid:1)(cid:66)(cid:1)(cid:41)(cid:80)(cid:69)(cid:72)(cid:76)(cid:74)(cid:79)(cid:1)(cid:77)(cid:90)(cid:78)(cid:81)(cid:73)(cid:80)(cid:78)(cid:66)(cid:1)(cid:68)(cid:70)(cid:77)(cid:77)(cid:1)(cid:77)(cid:74)(cid:79)(cid:70)(cid:28)(cid:1)(cid:66)(cid:79)(cid:69)(cid:1)(cid:44)(cid:22)(cid:23)(cid:19)(cid:1)(cid:9)(cid:36)(cid:37)(cid:18)(cid:26)(cid:109)(cid:13)(cid:1)(cid:36)(cid:37)(cid:25)(cid:17)(cid:109)(cid:13)(cid:1)(cid:36)(cid:37)(cid:25)(cid:23)(cid:109)(cid:10)(cid:13)(cid:1)(cid:66)(cid:79)(cid:1)(cid:70)(cid:83)(cid:90)(cid:85)(cid:73)(cid:83)(cid:80)(cid:74)(cid:69)(cid:1)(cid:77)(cid:70)(cid:86)(cid:76)(cid:70)(cid:78)(cid:74)(cid:66)(cid:1)(cid:68)(cid:70)(cid:77)(cid:77)(cid:1)(cid:77)(cid:74)(cid:79)(cid:70)(cid:1)(cid:85)(cid:73)(cid:66)(cid:85)(cid:1)(cid:74)(cid:84)(cid:1)(cid:84)(cid:86)(cid:84)(cid:68)(cid:70)(cid:81)(cid:85)(cid:74)(cid:67)(cid:77)(cid:70)(cid:1)(cid:85)(cid:80)(cid:1)
`(cid:79)(cid:66)(cid:85)(cid:86)(cid:83)(cid:66)(cid:77)(cid:1)(cid:76)(cid:74)(cid:77)(cid:77)(cid:70)(cid:83)(cid:1)(cid:68)(cid:70)(cid:77)(cid:77)(cid:1)(cid:66)(cid:68)(cid:85)(cid:74)(cid:87)(cid:74)(cid:85)(cid:90)(cid:15)(cid:1)(cid:35)(cid:80)(cid:85)(cid:73)(cid:1)(cid:36)(cid:34)(cid:51)(cid:15)(cid:36)(cid:37)(cid:18)(cid:26)ζ(cid:12)(cid:1)(cid:66)(cid:79)(cid:69)(cid:1)(cid:36)(cid:34)(cid:51)(cid:15)(cid:36)(cid:37)(cid:18)(cid:26)(cid:14)(cid:19)(cid:25)ζ(cid:12)(cid:1)(cid:53)(cid:1)(cid:68)(cid:70)(cid:77)(cid:77)(cid:84)(cid:1)(cid:84)(cid:81)(cid:70)(cid:68)(cid:74)(cid:71)(cid:74)(cid:68)(cid:66)(cid:77)(cid:77)(cid:90)(cid:1)(cid:85)(cid:66)(cid:83)(cid:72)(cid:70)(cid:85)(cid:70)(cid:69)(cid:1)(cid:36)(cid:37)(cid:18)(cid:26)(cid:12)(cid:1)(cid:85)(cid:86)(cid:78)(cid:80)(cid:83)(cid:84)(cid:15)(cid:1)(cid:37)(cid:66)(cid:85)(cid:66)(cid:1)(cid:66)(cid:83)(cid:70)(cid:1)(cid:78)(cid:70)(cid:66)(cid:79)(cid:1)(cid:153)(cid:1)(cid:52)(cid:37)(cid:1)(cid:71)(cid:80)(cid:83)(cid:1)(cid:85)(cid:73)(cid:70)(cid:1)(cid:23)(cid:1)(cid:53)(cid:1)(cid:68)(cid:70)(cid:77)(cid:77)(cid:1)
`(cid:77)(cid:74)(cid:79)(cid:70)(cid:84)(cid:15)(cid:1)(cid:9)(cid:36)(cid:10)(cid:1)(cid:49)(cid:73)(cid:70)(cid:79)(cid:80)(cid:85)(cid:90)(cid:81)(cid:74)(cid:68)(cid:1)(cid:68)(cid:80)(cid:78)(cid:81)(cid:80)(cid:84)(cid:74)(cid:85)(cid:74)(cid:80)(cid:79)(cid:1)(cid:80)(cid:71)(cid:1)(cid:36)(cid:34)(cid:51)(cid:15)(cid:36)(cid:37)(cid:18)(cid:26)ζ(cid:12)(cid:1)(cid:80)(cid:83)(cid:1)(cid:36)(cid:34)(cid:51)(cid:15)(cid:36)(cid:37)(cid:18)(cid:26)(cid:14)(cid:19)(cid:25)ζ(cid:12)(cid:1)(cid:53)(cid:1)(cid:68)(cid:70)(cid:77)(cid:77)(cid:84)(cid:15)(cid:1)(cid:53)(cid:73)(cid:70)(cid:84)(cid:70)(cid:1)(cid:81)(cid:83)(cid:80)(cid:69)(cid:86)(cid:68)(cid:85)(cid:84)(cid:1)(cid:68)(cid:80)(cid:79)(cid:85)(cid:66)(cid:74)(cid:79)(cid:70)(cid:69)(cid:1)(cid:67)(cid:80)(cid:85)(cid:73)(cid:1)(cid:36)(cid:37)(cid:25)(cid:12)(cid:1)(cid:66)(cid:79)(cid:69)(cid:1)(cid:36)(cid:37)(cid:21)(cid:12)(cid:1)(cid:36)(cid:34)(cid:51)(cid:14)(cid:70)(cid:89)(cid:81)(cid:83)(cid:70)(cid:84)(cid:84)(cid:74)(cid:79)(cid:72)(cid:1)
`(cid:53)(cid:1)(cid:68)(cid:70)(cid:77)(cid:77)(cid:84)(cid:1)(cid:85)(cid:73)(cid:66)(cid:85)(cid:1)(cid:66)(cid:83)(cid:70)(cid:1)(cid:81)(cid:83)(cid:70)(cid:69)(cid:80)(cid:78)(cid:74)(cid:79)(cid:66)(cid:79)(cid:85)(cid:77)(cid:90)(cid:1)(cid:36)(cid:37)(cid:21)(cid:22)(cid:51)(cid:48)(cid:12)(cid:36)(cid:37)(cid:23)(cid:19)(cid:45)(cid:12)(cid:13)(cid:1)(cid:88)(cid:74)(cid:85)(cid:73)(cid:1)(cid:66)(cid:1)(cid:71)(cid:83)(cid:66)(cid:68)(cid:85)(cid:74)(cid:80)(cid:79)(cid:1)(cid:80)(cid:71)(cid:1)(cid:85)(cid:73)(cid:70)(cid:78)(cid:1)(cid:70)(cid:89)(cid:81)(cid:83)(cid:70)(cid:84)(cid:84)(cid:74)(cid:79)(cid:72)(cid:1)(cid:36)(cid:37)(cid:19)(cid:25)(cid:15)(cid:1)(cid:38)(cid:66)(cid:68)(cid:73)(cid:1)(cid:84)(cid:90)(cid:78)(cid:67)(cid:80)(cid:77)(cid:1)(cid:83)(cid:70)(cid:81)(cid:83)(cid:70)(cid:84)(cid:70)(cid:79)(cid:85)(cid:84)(cid:1)(cid:66)(cid:79)(cid:1)(cid:74)(cid:79)(cid:69)(cid:74)(cid:87)(cid:74)(cid:69)(cid:86)(cid:66)(cid:77)(cid:1)(cid:68)(cid:70)(cid:77)(cid:77)(cid:1)(cid:77)(cid:74)(cid:79)(cid:70)(cid:13)(cid:1)(cid:66)(cid:79)(cid:69)(cid:1)
`(cid:73)(cid:80)(cid:83)(cid:74)(cid:91)(cid:80)(cid:79)(cid:85)(cid:66)(cid:77)(cid:1)(cid:67)(cid:66)(cid:83)(cid:84)(cid:1)(cid:69)(cid:70)(cid:79)(cid:80)(cid:85)(cid:70)(cid:1)(cid:78)(cid:70)(cid:66)(cid:79)(cid:1)(cid:72)(cid:83)(cid:80)(cid:86)(cid:81)(cid:1)(cid:87)(cid:66)(cid:77)(cid:86)(cid:70)(cid:84)(cid:15)
`
`then treated with both preparations at each level of dose escalation
`(2 × 107/m2, 1 × 108/m2, or 2 × 108/m2 cells per dose). The infusions
`were well tolerated without any immediate adverse side effects.
`A pivotal question in CAR-mediated cancer immunotherapy is
`whether the introduction of dual signaling domains will enhance
`the expansion and persistence of genetically modified T cells in
`human subjects, as observed in response to tumor cells in vitro
`when these cells lack expression of costimulatory molecules (Sup-
`plemental Figure 1). We therefore assessed these end points in the
`peripheral blood of our patients by quantitative PCR (Q-PCR)
`assays specific for CAR.CD19ζ and CAR.CD19-28ζ transgenes.
`As illustrated in Figure 2, the molecular signals identifying CAR.
`CD19-28ζ+ T cells were detected at a low level as early as 3 hours
`after the first infusion (63.5 ± 15.5 copies/μg of DNA); this level
`increased to 218.2 ± 60.6 copies/μg of DNA and 1,285.8 ± 585.4 cop-
`ies/μg of DNA at 1 and 2 weeks after infusion, respectively, repre-
`senting a mean 6.82-fold change over the 3-hour value. The signals
`identifying CAR.CD19-28ζ+ T cells reached a nadir by 4 to 6 weeks
`after infusion (42.6 ± 19.5 copies/μg of DNA). Despite this decline,
`
`the remaining peripheral blood CAR.CD19-28ζ+ T cells retained
`the capacity to expand when restimulated ex vivo by engagement
`of their native TCRs (Supplemental Figure 2). Molecular signals
`derived from the CAR.CD19ζ+ T cells were also detected at 3 hours
`after infusion (41.3 ± 13.8 copies/μg of DNA), but they failed to
`expand thereafter (35.9 ± 8.2 copies/μg of DNA and 26.6 ± 7.7
`copies/μg of DNA at 1 and 2 weeks after infusion, respectively),
`becoming virtually undetectable by 6 weeks after infusion (4.3 ± 2.2
`copies/μg of DNA) (Figure 2), with only marginal reexpansion upon
`TCR stimulation in vitro (Supplemental Figure 2). By repeated
`measure ANOVA, CAR.CD19-28ζ signals were significantly higher
`than CAR.CD19ζ signals at every time point tested over the first 4
`weeks after infusion (P < 0.0001). There was no evidence of a T cell–
`dose response based on the Q-PCR assay. However, the study is not
`powered enough to detect this difference, and no definite conclu-
`sion can be drawn on this matter. Since the T cell lines we infused
`were a mixture of CAR+ CD4+ and CD8+ cells, we asked whether
`both subsets had contributed to T cell expansion in vivo. Q-PCR
`analysis of DNA extracted from FACS-sorted CD4+ and CD8+ T
`
`The Journal of Clinical Investigation http://www.jci.org Volume 121 Number 5 May 2011
`
`(cid:18)(cid:25)(cid:19)(cid:20)
`
`UPenn Ex. 2010
`Miltenyi v. UPenn
`IPR2022-00855
`
`
`
`(cid:67)(cid:83)(cid:74)(cid:70)(cid:71)(cid:1)(cid:83)(cid:70)(cid:81)(cid:80)(cid:83)(cid:85)
`
`(cid:39)(cid:74)(cid:72)(cid:86)(cid:83)(cid:70)(cid:1)(cid:19)
`(cid:42)(cid:79)(cid:1)(cid:87)(cid:74)(cid:87)(cid:80)(cid:1)(cid:70)(cid:89)(cid:81)(cid:66)(cid:79)(cid:84)(cid:74)(cid:80)(cid:79)(cid:1)(cid:66)(cid:79)(cid:69)(cid:1)(cid:81)(cid:70)(cid:83)(cid:84)(cid:74)(cid:84)(cid:85)(cid:70)(cid:79)(cid:68)(cid:70)(cid:1)(cid:80)(cid:71)(cid:1)(cid:74)(cid:79)(cid:71)(cid:86)(cid:84)(cid:70)(cid:69)(cid:1)(cid:36)(cid:34)(cid:51)(cid:15)(cid:36)(cid:37)(cid:18)(cid:26)ζ(cid:12)(cid:1)(cid:87)(cid:70)(cid:83)(cid:84)(cid:86)(cid:84)(cid:1)(cid:36)(cid:34)(cid:51)(cid:15)(cid:36)(cid:37)(cid:18)(cid:26)(cid:14)(cid:19)(cid:25)ζ(cid:12)(cid:1)(cid:53)(cid:1)(cid:68)(cid:70)(cid:77)(cid:77)(cid:1)(cid:77)(cid:74)(cid:79)(cid:70)(cid:84)(cid:1)(cid:66)(cid:84)(cid:1)(cid:66)(cid:84)(cid:84)(cid:70)(cid:84)(cid:84)(cid:70)(cid:69)(cid:1)(cid:67)(cid:90)(cid:1)(cid:50)(cid:14)(cid:49)(cid:36)(cid:51)(cid:1)(cid:74)(cid:79)(cid:1)(cid:81)(cid:70)(cid:83)(cid:74)(cid:81)(cid:73)(cid:70)(cid:83)(cid:66)(cid:77)(cid:1)(cid:67)(cid:77)(cid:80)(cid:80)(cid:69)(cid:15)(cid:1)(cid:37)(cid:66)(cid:85)(cid:66)(cid:1)
`(cid:81)(cid:80)(cid:74)(cid:79)(cid:85)(cid:84)(cid:1)(cid:83)(cid:70)(cid:81)(cid:83)(cid:70)(cid:84)(cid:70)(cid:79)(cid:85)(cid:1)(cid:68)(cid:83)(cid:74)(cid:85)(cid:74)(cid:68)(cid:66)(cid:77)(cid:1)(cid:81)(cid:80)(cid:84)(cid:85)(cid:74)(cid:79)(cid:71)(cid:86)(cid:84)(cid:74)(cid:80)(cid:79)(cid:1)(cid:74)(cid:79)(cid:85)(cid:70)(cid:83)(cid:87)(cid:66)(cid:77)(cid:84)(cid:1)(cid:66)(cid:71)(cid:85)(cid:70)(cid:83)(cid:1)(cid:85)(cid:73)(cid:70)(cid:1)(cid:71)(cid:74)(cid:83)(cid:84)(cid:85)(cid:1)(cid:80)(cid:83)(cid:1)(cid:84)(cid:70)(cid:68)(cid:80)(cid:79)(cid:69)(cid:1)(cid:74)(cid:79)(cid:71)(cid:86)(cid:84)(cid:74)(cid:80)(cid:79)(cid:1)(cid:80)(cid:71)(cid:1)(cid:78)(cid:80)(cid:69)(cid:74)(cid:71)(cid:74)(cid:70)(cid:69)(cid:1)(cid:53)(cid:1)(cid:68)(cid:70)(cid:77)(cid:77)(cid:84)(cid:15)(cid:1)(cid:49)(cid:66)(cid:85)(cid:74)(cid:70)(cid:79)(cid:85)(cid:84)(cid:1)(cid:79)(cid:86)(cid:78)(cid:67)(cid:70)(cid:83)(cid:1)(cid:18)(cid:13)(cid:1)(cid:79)(cid:86)(cid:78)(cid:67)(cid:70)(cid:83)(cid:1)(cid:20)(cid:13)(cid:1)(cid:66)(cid:79)(cid:69)(cid:1)(cid:79)(cid:86)(cid:78)(cid:67)(cid:70)(cid:83)(cid:1)(cid:22)(cid:13)(cid:1)
`(cid:88)(cid:73)(cid:80)(cid:1)(cid:73)(cid:66)(cid:69)(cid:1)(cid:84)(cid:85)(cid:66)(cid:67)(cid:77)(cid:70)(cid:1)(cid:69)(cid:74)(cid:84)(cid:70)(cid:66)(cid:84)(cid:70)(cid:1)(cid:80)(cid:83)(cid:1)(cid:68)(cid:77)(cid:74)(cid:79)(cid:74)(cid:68)(cid:66)(cid:77)(cid:1)(cid:67)(cid:70)(cid:79)(cid:70)(cid:71)(cid:74)(cid:85)(cid:1)(cid:66)(cid:85)(cid:1)(cid:23)(cid:1)(cid:88)(cid:70)(cid:70)(cid:76)(cid:84)(cid:1)(cid:66)(cid:71)(cid:85)(cid:70)(cid:83)(cid:1)(cid:85)(cid:73)(cid:70)(cid:1)(cid:71)(cid:74)(cid:83)(cid:84)(cid:85)(cid:1)(cid:53)(cid:1)(cid:68)(cid:70)(cid:77)(cid:77)(cid:1)(cid:74)(cid:79)(cid:71)(cid:86)(cid:84)(cid:74)(cid:80)(cid:79)(cid:13)(cid:1)(cid:83)(cid:70)(cid:68)(cid:70)(cid:74)(cid:87)(cid:70)(cid:69)(cid:1)(cid:66)(cid:1)(cid:84)(cid:70)(cid:68)(cid:80)(cid:79)(cid:69)(cid:1)(cid:74)(cid:79)(cid:71)(cid:86)(cid:84)(cid:74)(cid:80)(cid:79)(cid:1)(cid:80)(cid:71)(cid:1)(cid:36)(cid:34)(cid:51)(cid:14)(cid:78)(cid:80)(cid:69)(cid:74)(cid:71)(cid:74)(cid:70)(cid:69)(cid:1)(cid:53)(cid:1)(cid:77)(cid:90)(cid:78)(cid:81)(cid:73)(cid:80)(cid:68)(cid:90)(cid:85)(cid:70)(cid:84)(cid:15)(cid:1)
`(cid:49)(cid:66)(cid:85)(cid:74)(cid:70)(cid:79)(cid:85)(cid:1)(cid:79)(cid:86)(cid:78)(cid:67)(cid:70)(cid:83)(cid:1)(cid:18)(cid:1)(cid:83)(cid:70)(cid:68)(cid:70)(cid:74)(cid:87)(cid:70)(cid:69)(cid:1)(cid:80)(cid:79)(cid:77)(cid:90)(cid:1)(cid:36)(cid:34)(cid:51)(cid:15)(cid:36)(cid:37)(cid:18)(cid:26)(cid:14)(cid:19)(cid:25)ζ(cid:12)(cid:1)(cid:53)(cid:1)(cid:68)(cid:70)(cid:77)(cid:77)(cid:84)(cid:1)(cid:9)(cid:19)(cid:1)×(cid:1)(cid:18)(cid:17)(cid:24)(cid:1)(cid:68)(cid:70)(cid:77)(cid:77)(cid:84)(cid:16)(cid:78)(cid:19)(cid:13)(cid:1)(cid:85)(cid:73)(cid:70)(cid:1)(cid:84)(cid:66)(cid:78)(cid:70)(cid:1)(cid:66)(cid:84)(cid:1)(cid:71)(cid:80)(cid:83)(cid:1)(cid:85)(cid:73)(cid:70)(cid:1)(cid:71)(cid:74)(cid:83)(cid:84)(cid:85)(cid:1)(cid:74)(cid:79)(cid:71)(cid:86)(cid:84)(cid:74)(cid:80)(cid:79)(cid:10)(cid:13)(cid:1)(cid:67)(cid:70)(cid:68)(cid:66)(cid:86)(cid:84)(cid:70)(cid:1)(cid:85)(cid:73)(cid:74)(cid:84)(cid:1)(cid:88)(cid:66)(cid:84)(cid:1)(cid:85)(cid:73)(cid:70)(cid:1)(cid:80)(cid:79)(cid:77)(cid:90)(cid:1)(cid:81)(cid:83)(cid:80)(cid:69)(cid:86)(cid:68)(cid:85)(cid:1)
`(cid:66)(cid:87)(cid:66)(cid:74)(cid:77)(cid:66)(cid:67)(cid:77)(cid:70)(cid:15)(cid:1)(cid:49)(cid:66)(cid:85)(cid:74)(cid:70)(cid:79)(cid:85)(cid:1)(cid:79)(cid:86)(cid:78)(cid:67)(cid:70)(cid:83)(cid:1)(cid:20)(cid:1)(cid:83)(cid:70)(cid:68)(cid:70)(cid:74)(cid:87)(cid:70)(cid:69)(cid:1)(cid:67)(cid:80)(cid:85)(cid:73)(cid:1)(cid:36)(cid:34)(cid:51)(cid:15)(cid:36)(cid:37)(cid:18)(cid:26)(cid:14)(cid:19)(cid:25)ζ(cid:12)(cid:1)(cid:66)(cid:79)(cid:69)(cid:1)(cid:36)(cid:34)(cid:51)(cid:15)(cid:36)(cid:37)(cid:18)(cid:26)ζ(cid:12)(cid:1)(cid:53)(cid:1)(cid:68)(cid:70)(cid:77)(cid:77)(cid:84)(cid:13)(cid:1)(cid:67)(cid:86)(cid:85)(cid:1)(cid:85)(cid:73)(cid:70)(cid:1)(cid:68)(cid:70)(cid:77)(cid:77)(cid:1)(cid:69)(cid:80)(cid:84)(cid:70)(cid:1)(cid:88)(cid:66)(cid:84)(cid:1)(cid:23)(cid:17)(cid:6)(cid:1)(cid:80)(cid:71)(cid:1)(cid:85)(cid:73)(cid:70)(cid:74)(cid:83)(cid:1)(cid:71)(cid:74)(cid:83)(cid:84)(cid:85)(cid:1)(cid:69)(cid:80)(cid:84)(cid:70)(cid:1)(cid:9)(cid:18)(cid:1)×(cid:1)(cid:18)(cid:17)(cid:25)(cid:1)(cid:68)(cid:70)(cid:77)(cid:77)(cid:84)(cid:16)(cid:78)(cid:19)(cid:10)(cid:15)(cid:1)(cid:1)
`(cid:49)(cid:66)(cid:85)(cid:74)(cid:70)(cid:79)(cid:85)(cid:1)(cid:79)(cid:86)(cid:78)(cid:67)(cid:70)(cid:83)(cid:1)(cid:22)(cid:1)(cid:83)(cid:70)(cid:68)(cid:70)(cid:74)(cid:87)(cid:70)(cid:69)(cid:1)(cid:67)(cid:80)(cid:85)(cid:73)(cid:1)(cid:36)(cid:34)(cid:51)(cid:15)(cid:36)(cid:37)(cid:18)(cid:26)(cid:14)(cid:19)(cid:25)ζ(cid:12)(cid:1)(cid:66)(cid:79)(cid:69)(cid:1)(cid:36)(cid:34)(cid:51)(cid:15)(cid:36)(cid:37)(cid:18)(cid:26)ζ(cid:12)(cid:1)(cid:53)(cid:1)(cid:68)(cid:70)(cid:77)(cid:77)(cid:84)(cid:1)(cid:66)(cid:85)(cid:1)(cid:85)(cid:73)(cid:70)(cid:1)(cid:84)(cid:66)(cid:78)(cid:70)(cid:1)(cid:69)(cid:80)(cid:84)(cid:70)(cid:1)(cid:66)(cid:69)(cid:78)(cid:74)(cid:79)(cid:74)(cid:84)(cid:85)(cid:70)(cid:83)(cid:70)(cid:69)(cid:1)(cid:69)(cid:86)(cid:83)(cid:74)(cid:79)(cid:72)(cid:1)(cid:85)(cid:73)(cid:70)(cid:74)(cid:83)(cid:1)(cid:71)(cid:74)(cid:83)(cid:84)(cid:85)(cid:1)(cid:74)(cid:79)(cid:71)(cid:86)(cid:84)(cid:74)(cid:80)(cid:79)(cid:1)(cid:9)(cid:19)(cid:1)×(cid:1)(cid:18)(cid:17)(cid:25)(cid:1)
`(cid:68)(cid:70)(cid:77)(cid:77)(cid:84)(cid:16)(cid:78)(cid:19)(cid:10)(cid:15)(cid:1)(cid:48)(cid:81)(cid:70)(cid:79)(cid:1)(cid:66)(cid:83)(cid:83)(cid:80)(cid:88)(cid:84)(cid:1)(cid:74)(cid:79)(cid:69)(cid:74)(cid:68)(cid:66)(cid:85)(cid:70)(cid:1)(cid:85)(cid:73)(cid:70)(cid:1)(cid:85)(cid:74)(cid:78)(cid:70)(cid:1)(cid:80)(cid:71)(cid:1)(cid:53)(cid:1)(cid:68)(cid:70)(cid:77)(cid:77)(cid:1)(cid:74)(cid:79)(cid:71)(cid:86)(cid:84)(cid:74)(cid:80)(cid:79)(cid:13)(cid:1)(cid:66)(cid:79)(cid:69)(cid:1)(cid:69)(cid:66)(cid:84)(cid:73)(cid:70)(cid:69)(cid:1)(cid:66)(cid:83)(cid:83)(cid:80)(cid:88)(cid:84)(cid:1)(cid:74)(cid:79)(cid:69)(cid:74)(cid:68)(cid:66)(cid:85)(cid:70)(cid:1)(cid:85)(cid:73)(cid:70)(cid:1)(cid:85)(cid:74)(cid:78)(cid:70)(cid:1)(cid:88)(cid:73)(cid:70)(cid:79)(cid:1)(cid:68)(cid:73)(cid:70)(cid:78)(cid:80)(cid:85)(cid:73)(cid:70)(cid:83)(cid:66)(cid:81)(cid:90)(cid:1)(cid:88)(cid:66)(cid:84)(cid:1)(cid:74)(cid:79)(cid:74)(cid:85)(cid:74)(cid:66)(cid:85)(cid:70)(cid:69)(cid:1)(cid:71)(cid:80)(cid:83)(cid:1)(cid:69)(cid:74)(cid:84)(cid:70)(cid:66)(cid:84)(cid:70)(cid:1)
`(cid:81)(cid:83)(cid:80)(cid:72)(cid:83)(cid:70)(cid:84)(cid:84)(cid:74)(cid:80)(cid:79)(cid:15)(cid:1)(cid:49)(cid:83)(cid:70)(cid:13)(cid:1)(cid:67)(cid:70)(cid:71)(cid:80)(cid:83)(cid:70)(cid:1)(cid:85)(cid:73)(cid:70)(cid:1)(cid:71)(cid:74)(cid:83)(cid:84)(cid:85)(cid:1)(cid:74)(cid:79)(cid:71)(cid:86)(cid:84)(cid:74)(cid:80)(cid:79)(cid:28)(cid:1)(cid:49)(cid:83)(cid:70)(cid:1)(cid:42)(cid:42)(cid:13)(cid:1)(cid:67)(cid:70)(cid:71)(cid:80)(cid:83)(cid:70)(cid:1)(cid:85)(cid:73)(cid:70)(cid:1)(cid:84)(cid:70)(cid:68)(cid:80)(cid:79)(cid:69)(cid:1)(cid:74)(cid:79)(cid:71)(cid:86)(cid:84)(cid:74)(cid:80)(cid:79)(cid:15)
`
`cells from patients number 3 and number 5 indicated that both
`CD4+ and CD8+ T cells can contribute to the in vivo expansion of
`CAR.CD19-28ζ+ T cells (Supplemental Figure 3).
`Two patients (number 1 and number 3) with stable disease and
`one patient (number 5) with minimal progression at 1 site of dis-
`ease after the first infusion were treated with the same T cell prod-
`ucts 6 or more weeks after the first infusion to increase potential
`clinical benefits (Supplemental Table 1). The differential pattern
`of molecular signals over time, after the second infusion, was simi-
`lar to that observed after the first infusion (Figure 2), such that
`only CAR.CD19-28ζ+ T cells showed any discernible expansion.
`This suggests that the decline of T cell persistence after the first
`infusion was unlikely to have been determined by rapid immune
`elimination of the gene-modified T cells (19).
`Conceivably, the differences we observed in the expansion and
`survival of these CAR-modified T cells could be explained by the
`preferential accumulation of CAR.CD19ζ+ T cells in malignant
`
`tissues, as compared with that of CAR.CD19-28ζ+ T cells. We
`therefore analyzed tissue sections taken from a cutaneous lesion
`of patient number 5 at 2 weeks after the second T cell infusion.
`Phenotypic analysis of lymphocytes from this tissue revealed the
`presence of CAR+ T cells (Figure 3), which, by Q-PCR analysis,
`proved to be exclusively CAR.CD19-28ζ+ T cells, corresponding to
`the preponderance of these cells in peripheral blood.
`Our results clearly demonstrate that CD28 costimulation
`improves the in vivo expansion and persistence of CAR-modified
`T cells in the peripheral blood as compared with that of T cells
`with a single signaling domain. Moreover, the presence of CAR.
`CD19-28ζ+ T cells in a cutaneous tumor biopsy suggests that the
`superior expansion and persistence conferred by the second-gen-
`eration CAR in peripheral blood may extend to cells infiltrating
`tumor sites. Although the gains in T cell responses achieved with
`CD28 costimulation are encouraging, they still may be too short
`lived to produce meaningful clinical benefits. Indeed, despite
`
`(cid:18)(cid:25)(cid:19)(cid:21)
`
`The Journal of Clinical Investigation http://www.jci.org Volume 121 Number 5 May 2011
`
`UPenn Ex. 2010
`Miltenyi v. UPenn
`IPR2022-00855
`
`
`
`(cid:67)(cid:83)(cid:74)(cid:70)(cid:71)(cid:1)(cid:83)(cid:70)(cid:81)(cid:80)(cid:83)(cid:85)
`
`(cid:46)(cid:70)(cid:85)(cid:73)(cid:80)(cid:69)(cid:84)
`Patients. This study was open to
`patients with recurrent or refracto-
`ry NHL or those unable to receive
`or complete standard therapy.
`We obtained 30–60 ml peripheral
`blood for the production of gene-
`modified T cells, under current
`“good-tissue practice” conditions.
`The investigation was approved by
`the US Food and Drug Adminis-
`tration, the Recombinant DNA
`Advisory Committee, and the
`Institutional Review Board of Bay-
`lor College of Medicine. All par-
`ticipants gave informed consent
`upon enrollment.
`T cell infusions. All individuals
`received the T cell products at
`least 6 weeks after the last chemo-
`therapy treatment. At the time of
`infusion, patients had measurable
`disease by imaging studies (CT or
`PET scan) or by physical examina-
`tion (skin lesion in 1 patient). T
`cell products expressing either the
`CAR.CD19ζ or CAR.CD19-28ζ
`transgenes were administered
`simultaneously to each patient
`(Supplemental Table 1). Second infusions were allowed if there was evidence
`of clinical benefit (including stable disease or partial response) at 6 weeks
`after the first infusion as assessed by Response Evaluation Criteria in Solid
`Tumors (24). We assessed toxicity on the basis of patient interviews, physical
`examinations, and laboratory tests of organ function at 1, 2, 4, and 6 weeks
`and 3, 6, 9, and 12 months after infusion.
`Generation of retroviral constructs. The scFv domain targeting the CD19 anti-
`gen was provided by Heddy Zola (Child Health Research Institute, Women’s
`and Children’s Hospital, Adelaide, South Australia, Australia) (16). CAR.
`CD19ζ and CAR.CD19-28ζ vectors were generated as previously described
`(25). A spacer region derived from the human IgG1-CH2CH3 domain was
`cloned in-