Spectrum Ex. 1004
`IPR Petition - USP 10,000,795
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`DE 102 19 117 Cl
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`Beschreibung
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`[0001] Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Stabilisierung von Ribonukleinsduren und Ver-
`wendungen von Stabilisierungspuffern. Derartige Verfahren werden bei der Aufreinigung von Ribonukleinsauren (RNS)
`bendtigt.
`[0002] Ribonukleinsauren besitzen einen hohen Informationsgehalt und sind haéufiger Gegenstand der molekularbiolo-
`gischen Diagnostik. Im Gegensatz zu DNSist RNSsehrviel instabiler und demnach schwieriger zu handhaben (Pas-
`loske, 2001: Methods in Molecular Biology, vol 160, 105-111).
`[0003] Die RNA-Degradation durch ubiquitér vorkommende RNAsen vor, wahrend und nach Isolierung von RNS
`stellt ein groBes Problem dar, da die Integritaét der RNS Voraussetzungfiir die molekularbiologische Diagnostik ist.
`[0004] Studien haben gezeigt, daB die RNS aus humanem Vollblut innerhalb weniger Stunden nach der Blutentnahme
`signifikant degradiert wird (McFaulet al., 2000, J. Lab. Clin Med., 135 (3), 263-269), was die Moglichkeiten fiir den
`Probentransport sehrstark einengt. Die Degradation der RNA kann dadurch zu falsch negativen Ergebnissen fiihren, daB
`die durch Abbauverringerte Transkriptzahl in vitro mit der Transkriptzahlin vivo nicht korreliert.
`[0005] Fiir die Integritat der RNS sind das Hemmen endogener RNAsen wahrend der Zellyse und das Vermeiden von
`Kontaminationen mit exogenen RNAsen wahrend der RNS-Isolierung unerlaBlich.
`[0006] Die Inhibierung von RNAsen kann durch Zugabe chemischer Agenzien oder einiger Enzymeerfolgen:
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`— Stark denaturierende Agenzien wie 8 M Harnstoff, 4 Mol/l Guanidiniumhydrochlorid, 4 Mol/l Guanidiniumisot-
`hiocyanat bewirken sowohldie Lyse der Zelle als auch die Inaktivierung von RNAsen.
`— Vanadyl-Ribonukleosid-Komplexe (VRC): binden ein breites Spektrum an RNAsen,inhibieren allerdings aber
`auch andere Enzyme(s. unten)
`— komplexierende Agenzien: z. B. Feststoffe wie Bentonit, Macaloid,die die RNAsen binden und dadurch von den
`sich in Lésungen befindlichen RNAsen trennen,
`— Enzyme:
`Proteinase K verdaut Zellproteine und ist in Gegenwart von Na-Dodecylsufat (SDS) bei 65°C sehraktiv (1);
`RNAse-Inhibitor aus humanem Plazenta, Rnasin: sie schiitzen die RNA vor Degradation nurunter nicht denaturie-
`renden Bedingungen (Murphyet al., 1995: BioTechniques, Vol. 18, No. 6, 1068-1073).
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`[0007] All diese Reagenzein haben starke Begrenzungen: geringes RNAsen-Wirkungsspektrum,Inhibierung zusatzli-
`cher Enzyme,die fiir den anschlieBenden Nachweis von RNSessentiell sind (VRC's hemmen RNS-Polymerasen und in
`vitro Transkription/ Translation (Pasloske, 2001: Methods in Molecular Biology, vol. 160, 105-111), Nichtanwendbar-
`keit wahrend der Zellyse (RNAsin und andere enzymatische RNAse-Inhibitoren sind nur unter nicht denaturierenden Be-
`dingungen aktiv und eignen sich dadurch nicht fiir Inhibition wahrend der ersten Schritte bei der RNA-Aufreinigung).
`[0008] Aufgabe der vorliegenden Erfindungist es, ein verbessertes Stabilisierungsverfahren fiir Ribonukleinsduren an-
`zugeben.
`[0009] Diese Aufgabe wird durch die Verwendung von Lithium-Dodecylsulfat nach Anspruch 1 sowie das Verfahren
`nach Anspruch 10 gelést. Vorteilhafte Weiterbildung der erfindungsgemafen Verwendung sowie des erfindungsgeméfen
`Verfahrens werden in den jeweiligen abhangigen Ansprtichen gegeben.
`[0010] Grundlage der vorliegenden Erfindung ist die Erkenntnis, da8 Lithium-Dodecylsulfat eine Stabilisierung von
`RNS in Lésung bewirkt. Es konnte tiberraschenderweise gezeigt werden, das RNS durch Zugabe von Lithium-Dodecyl-
`sulfat tiber viele Stunden bis Tage stabilisiert wird, obwohlin der jeweiligen Lésung RNAsen vorhanden waren. Dies
`spielt insbesondere dann eine Rolle, wenn tierische Zellen beispielsweise durch Lyse oder osmotischen Schock aufge-
`schlossen werden und die RNS sowie RNAsen gemeinsam in der Lésung vorliegen.
`[0011] Besonders vorteilhaft ist dabei eine Stabilisierungslésung mit einem Gehalt an Lithium-Dodecylsulfat von
`0,1% (Gew/Vol) bis 5% (Gew/Vol).
`[0012] Besonders vorteilhaft ist es, wenn die Stabilisierungslésung ca. 1% (Gew/Vol) Lithium-Dodecylsulfat enthalt.
`[0013] Weiterhin wird die stabilisierende Wirkung unterstiitzt, wenn als Salz Lithiumchlorid (LiCl) der Stabilisie-
`rungslésung zugegeben wird, vorteilhafter Weise mit einer Konzentration zwischen 100 mMol/l und 2 Mol/1.
`[0014] Eine weitere Stiitzung der Stabilisierungswirkung wird durch Zugabe von Dithiothreitol (DTT) bewirkt.
`[0015]
`Im Folgendem wird ein Beispiel fiir die Durchfiihrung einer erfindungsgemaBen RNS-Stabilisierung gegeben.
`[0016] Fig. 1 zeigt die Ergebnisse einer Messung an frisch préparierter RNS sowie nach einer3-stiindigen, 24-stiindi-
`gen bzw. 48-stiindigen Inkubation in der erfindungsgemafen Stabilisierungslésung. Dabei wurden jeweils insgesamt 4
`Proben untersucht, die keine Tumorzellen, 10 Tumorzellen, 100 Tumorzellen bzw. 1000 Tumorzellen pro ml Blutprobe
`enthielten.
`[0017] Dazu wurdeeine definierte Anzahl an Tumorzellen (0/10/100/1000 Zellen) in jeweils 1 ml Blut einer gesunden
`Kontrollperson inokuliert, mit Hilfe von Antikorper-gekoppelten Magnetpartikeln von den nicht bindenden Blutbestand-
`teilen separiert undin jeweils 100 pl Lysepuffer (50 mM Tris-HCl pH 7,5; 0,5% (Vol/Vol) Triton X100) aufgenommen.
`Die separierten Zellen werden auf den Partikeln lysiert.
`[0018] Nach Abtrennen der immunomagnetischen Partikel werden 100 pil des RNA-stabilisierenden Puffers enthaltend
`150 mMol/! Tris-HC1 pH 7.5
`1,5 Mol/l LiCl
`20 mMol/l EDTA pH 8.0
`2% (Gew/Vol) Li-Dodecylsulfat
`10 mMol/! Dithiothreitol
`zugegeben. Diese Lésung wurdefiir verschiedene Zeiten (0, 3, 24 und 48 Stunden) bei Raumtemperatur inkubiert. An-
`schliefiend erfolgte eine mRNS-Isolierung mit Hilfe von Oligo(dT)25 gekoppelten Magnetpartikeln (Dynabeads der
`Firma Dynal). Die Aufarbeitung erfolgte gema8% dem Protokoll im Handbuch der Firma Dynal. Das Lysat wurde mit den
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`Magnetpartikeln (20 pl Oligo(dT))5-Dynabeads pro Ansatz) ftir 10 Minuten bei Raumtemperatur unter Drehen auf dem
`Uber-Kopf-Schiittler inkubiert. AnschlieBend erfolgen jeweils 2 Waschschritte mit jeweils 100 pl Waschpuffer A bzw.
`Waschpuffer B.
`A:
`10 mMol/! Tris-HCl pH 7.5
`0,15 Mol/l LiCl]
`1 mMol/l EDTA ph 8.0
`0,1% (Gew/Vol) Li-Dodecylsulfat
`B:
`10 mMol/! Tris-HCl pH 7.5
`0,15 Mol/l LiCl]
`1 mMol/l EDTA ph 8.0
`[0019] Nach dem ersten Waschschritt mit Waschpuffer B wird die Reaktionslésung in ein neues ReaktionsgefaBtiber-
`fiihrt. Dann wird die an die Magnetpartikel gebundene mRNS mit 100 ul eiskalter 10 mMol/1 Tris-HCl] Lésung gewa-
`schen und in 29,5 pl RNAse-freiem Wasser resuspendiert. Nach 5-miniitiger Inkubation bei 50°C unter leichtem Schiit-
`teln erfolgte eine herkOmmliche cDNS-Synthese. AnschlieBend wurde eine Polymerasekettenreaktion (PCR) mit tumor-
`markerspezifischen Primern durchgeftihrt. Die Amplifikate wurden im Agilent Bioanalyzer 2100 aufgetrennt und visua-
`lisiert. Die Verfahrensschritte der Reversen Transkription und Amplifikation erfolgten unter den nachstehend beschrie-
`benen Bedingungen:
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`[0020] Die cDNA-Synthese erfolgte bei 37°C fiir 1 Stunde mit nachfolgender Inaktivierung der Reversen Transkrip-
`tase fiir. 5 Minuten bei 93°C und Abkiihlung auf Eis. (Sensiscript™ Reverse Transcriptase Kit; Qiagen, Hilden)
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`Reverse Transkription
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`Tabelle 1
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`Komponenten der cDNA-Synthese
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`Die cDNA-Synthese erfolgte in einem 40 pl-Reaktionsansatz
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`30
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`RNAinWasser[29,5pt[|
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`Rnase-Inhibitor
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`[0021] Die Polyymerasekettenreaktion (PCR) wurde mit tumormarkerspezifischen Primern durchgefiihrt.
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`Amplifikation
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`CK20 sense T60: ATC TCC AAG GCC TGA ATA AGG TCT
`CK20 antisense T61: CCT CAG TTC CTT TTA ATT CTT CAG T
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`Verwendete PCR-Primer
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`Tabelle 2
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`Komponenten der PCR-Reaktion
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`CDNA
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`Endkonzentration
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`10xpeR-Puffer+[5nx
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`oNrp-Mix[tnt|eweils 200 Mol
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`‘Taq-DNAPolymerase**|0.5pt [2.5 U
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`(* enthalt 15 mMol/1 MgCl,; ** HotStarTaq™ DNA Polymerase; Qiagen,
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`Hilden)
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`Tabelle 3
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`PCR-Bedingungen
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`1. Denaturierung
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`94 °C
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`1 min
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`Vorabdenaturierung
`95 °c
`15 min
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`Zyklus (35 Zyklen)
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`Finale Extension
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`72 °C 10min
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`°C Pause
`4
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`1 ul des jeweiligen PCR-Ansatzes wurde im Agilent Bioanalyzer 2100 auf einem DNA-Chip (500) aufgetrennt
`[0022]
`und das Trennergebnis elektronisch dokumentiert.
`[0023] Fig. 1 zeigt nun in Spur 1 eine Leiter aus Markern fiir das Molekulargewicht. Die Spuren 2-5, 6-9, 10-13,
`14-17 entsprechend den Proben,die 0, 3, 24, 48 Stunden vorder Isolierung der RNS in der Stabilisierungslésung inku-
`biert wurden. In jeder dieser Gruppen von Spurenzeigt jeweils eine Spur die Probe mit 0, 10, 100 bzw. 1000 Tumorzellen
`in der Ausgangsblutprobe, wie oberhalb der Figur beschriftetist.
`[0024]
`&sist unmittelbar zu erkennen, da der mit Pfeil bezeichnete Tumormarkerdeutlich und in nahezu unverdnder-
`ter Intensitat bei den 0, 3 bzw. 24 Stunden inkubierten Proben in jeder der Proben, die Tumorzellen enthielt, zu erkennen
`ist. Lediglich bei den 48 Stunden inkubierten Probenistfiir die Probe mit 10 Tumorzellen in der Ausgangsblutprobe kein
`Tumormarker-Signal (Bande) zu erkennen. Offensichtlich hat hier ein geringer Abbau von RNSstattgefunden. Dennoch
`ist bei den Blutproben mit 100 bzw. 1000 Tumorzellen der Tumormarker noch deutlich nachzuweisen. Damitist gezeigt,
`daB die Stabilisierungslosung bewirkt, daf} tiber mindestens 1 Tag und bei entsprechender RNS-Konzentration 2 Tagen
`die RNSin der Stabilisierungslésung nicht bzw. extrem langsam abgebaut wird.
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`Patentanspriiche
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`1. Verwendung von Lithium-Dodecylsulfat zur Stabilisierung von RNSin einer Lésung.
`2. Verwendung nach dem vorhergehenden Anspruchzur Stabilisierung von RNSin einer biologischen Probe.
`3. Verwendung nach dem vorhergehenden Anspruch zur Stabilisierung von RNSin einem ZellaufschluB.
`4. Verwendung nach dem vorhergehenden Anspruch zurStabilisierung von RNSin einem Zellaufschlu8 tierischer
`oder menschlicher Zellen.
`5. Verwendung nach einem der vorhergehenden Anspriiche zur Stabilisierung von RNSin einer Blutprobe.
`6. Verwendung nach einem der vorhergehenden Anspriiche in einer Konzentration von 0,1% bis 5% (Gew/Vol) Li-
`Dodecylsulfat.
`7, Verwendung nach einem der vorhergehenden Anspriiche in einer Konzentration von 2% (Gew/Vol) Li-Dodecyl-
`sulfat.
`8. Verwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Lésung weiterhin die folgenden Bestandteile
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`2. Annealing
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`58 °C
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`1 min
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`enthalt:
`10-500 mMol/1 Tris-HCI pH 6,5-8,5 und/oder
`100-3500 mMol/1 LiCl und/oder
`1-100 mMol/l EDTA und/oder
`1-50 mMol/1 Dithiothreitol,
`9. Verwendung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daB die Lésung weiterhin folgenden Bestandteile ent-
`halt:
`150 mMol/1 Tris-HCI pH 7.5 und/oder
`1,5 mMol/] LiCl und/oder
`20 mMol/l EDTA und/oder
`10 mMol/l D
`ithiothreitol.
`10. Verfahre
`n zur Stabilisierung von RNS ineiner Probe, in biologischen Proben, Proben enthaltendtierische und/
`oder menschliche Zellen und/oder in Blutproben, dadurch gekennzeichnet, da die Probe mit einer Stabilisierungs-
`lésung versetzt wird, die Lithiumdodecylsulfat enthalt.
`11. Verfahre n nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe mit einer Stabilisie-
`rungslésung versetzt wird, die 0,1% bis 5% (Gew/Vol) Lithium-Dodecylsulfat enthalt.
`12. Verfahre
`n nach einem der beiden vorhergehenden Anspriiche, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe mit ei-
`ner Stabilisie:
`rungslésung versetzt wird, die 2% (Gew/Vol) Lithium-Dodecylsulfat enthalt.
`13. Verfahre
`n nach einem der Anspriiche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe mit einer Stabilsie-
`rungslésung versetzt wird, die
`10-500 mMol/1 Tris-HCI pH 6,5-8,5 und/oder
`100-3500 mMol/l LiCl] und/oder
`1-100 mMol/l EDTA und/oder
`1-50 mMol/1 Dithiothreitol enthalt.
`14. Verfahre
`n nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe mit einer Stabilisierungslésung versetzt
`wird, die
`150 mMol/1 Tris-HCI pH 7.5 und/oder
`1,5 mMol/] LiCl und/oder
`20 mMol/l EDTA und/oder
`10 mMol/l D
`ithiothreitol enthalt.
`15. Verfahre:
`n nach einem der Anspriiche 10 bis 14, dadurch gekennzeichnet, da anschlieBend die RNS aus der
`Probe isoliert, aufgereinigt oder angereichert wird.
`16. Verfahre:
`n nach einem der Anspriiche 10 bis 15, dadurch gekennzeichnet, da} nach der ZugabederStabilisie-
`die freie RNS an ein Substrat gebunden, dieses mindestens einmal gewaschen und anschlieBend die
`rungslésung
`RNSvon dem Substrat abgeldst wird.
`17. Verfahre: n nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, da8 als Substrat magnetische Partikel
`verwendet werden.
`18. Verfahre n nach einem der Anspriiche 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, daB die RNS mittels einer
`10 mMol/1 Tris-HCI-Lésung in H20, pH 7,5 von den magnetischen Partikeln abgelést wird.
`19. Verfahre n nach einem der Anspriiche 16 bis 18, dadurch gekennzeichnet, da8 die RNS nach der Ablésung vom
`Substrat in einen RNAse-freien Puffer aufgenommen wird.
`20. Verfahre n nach einem der Anspriiche 10 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daB RNS-haltige Komponenten aus
`der Probe abgetrennt werden, bevordie Stabilisierungslésung zu den abgetrennten Komponenten zugegeben wird.
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`21. Verfahre n nach einem der Anspriiche 10 bis 20, dadurch gekennzeichnet, da Zellen aus einer Blutprobe abge-
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`trennt werden, bevordie Stabilisierungslésung zu den abgetrennten Zellen zugegeben wird.
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`Hierzu 1 Seite(n) Zeichnungen
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`ZEICHNUNGEN SEITE1
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`Nummer:
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`DE 102 19 117 C1
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`C12N 15/10
`30. Oktober 2003
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`I‘Sly
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`Int. Cl.?:
`
`Veroffentlichungstag:
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`203 440/210
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