(12) DEMANDE INTERNATIONALE PUBLIEE EN VERTU DU TRAITE DE COOPERATION
`EN MATIERE DE BREVETS (PCT)
`
`(19) Organisation Mondiale de la Propriété
`Intellectuelle
`Bureau international
`
`(43) Date de la publication internationale
`12 juin 2008 (12.06.2008)
`
` .,
`
`(10) Numéro de publication internationale
`WO 2008/068297 A1
`
`(51) Classification internationale des brevets :
`A61L 27/20 (2006.01)
`A61K 8/73 (2006.01)
`A61L 27/52 (2006.01)
`A6IQ 19/08 (2006.01)
`
`(21) Numéro de la demande internationale :
`PCT/EP2007/063384
`
`(22) Date de dépét international :
`6 décembre 2007 (06.12.2007)
`
`(25) Langue de dépét :
`
`(26) Langue de publication :
`
`frangais
`
`frangais
`
`(30) Données relatives a la priorité :
`06/10645
`6 décembre 2006 (06.12.2006)
`
`FR
`
`:
`(pour tons [es Etats de’signe’s sauf US)
`(71) Déposant
`PIERRE FABRE DERMO-COSMETIQUE [FR/FR];
`45, place Abel Gance, F—92100 Boulogne—Billancourt
`(FR).
`
`(72) Inventeur; et
`(75) Inventeur/Déposant (pour US settlement) : PIRON, Es-
`telle [FR/FR]; 558, rue Ampére, F—73540 La Bathie (FR).
`
`(74) Mandataire : WARCOIN, AHNER, TEXIER, LE
`FORESTIER, CALLON DE LAMARCK, COLLIN,
`TETAZ-CABINET REGIMBEAU; 20, rue de Chazelles,
`F—75847 Paris Cedex 17 (FR).
`
`(81) Etats désignés (sauf indication contraire, pour tout titre de
`protection nationale disponible) : AE, AG, AL, AM, AT,
`AU, AZ, BA, BB, BG, BH, BR, BW, BY, BZ, CA, CH, CN,
`CO, CR, CU, CZ, DE, DK, DM, DO, DZ, EC, EE, EG, ES,
`FI, GB, GD, GE, GH, GM, GT, HN, HR, HU, ID, IL, IN,
`IS, JP, KE, KG, KM, KN, KP, KR, KZ, LA, LC, LK, LR,
`LS, LT, LU, LY, MA, MD, ME, MG, MK, MN, MW, MX,
`MY, MZ, NA, NG, NI, NO, NZ, OM, PG, PH, PL, PT, RO,
`RS, RU, SC, SD, SE, SG, SK, SL, SM, SV, SY, TJ, TM,
`TN, TR, TT, TZ, UA, UG, US, UZ, VC, VN, ZA, ZM, ZW.
`
`(84) Etats désignés (sauf indication contraire, pour tout titre
`de protection re’gionale disponible) : ARIPO (BW, GH,
`GM, KE, LS, MW, MZ, NA, SD, SL, SZ, TZ, UG, ZM,
`ZW), eurasien (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM),
`européen (AT, BE, BG, CH, CY, CZ, DE, DK, EE, ES, FI,
`FR, GB, GR, HU, IE, IS, IT, LT, LU, LV, MC, MT, NL, PL,
`PT, RO, SE, SI, SK, TR), OAPI (BF, BJ, CF, CG, CI, CM,
`GA, GN, GQ, GW, ML, MR, NE, SN, TD, TG).
`
`Déclaration en vertu de la regle 4.17 :
`— relative a la qualite’ d’inventeur (regle 4.17.iv))
`
`Publiée :
`
`avec rapport de recherche internationale
`
`(54) Title: HYALURONIC ACID GEL FOR INTRADERMAL INJECTION
`
`(54) Titre : GEL D’ACIDE HYALURONIQUE POUR INJECTION INTRADERMIQUE
`
`(57) Abstract: Implant that can be injected subcutaneously or intradermally in the form of a single—phase hydrogel comprising a
`gel composed of crosslinked hyaluronic acid and one of its physiologically acceptable salts.
`
`(57) Abrégé : Implant injectable par voie sous—cutanée ou intradermique sous la forme d'un hydrogel mo nophasique comprenant
`un gel constitué d'acide hyaluronique réticulé et l'un de ses sels physiologiquement acceptables.
`
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`Teoxane S.A.
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`Exhibit
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`lOlO
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`W02008/068297A1|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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`WO 2008/068297
`
`PCT/EP2007/063384
`
`Gel d'acide hyaluronique pour injection intradermique
`
`La presente invention conceme des implants injectables par voie sous-cutanee
`
`ou intradermique a base d’acide hyaluronique.
`
`L’acide hyaluronique (HA) sous sa forme acide ou sous forme de sel
`
`(hyaluronate) est la composante majeure de la matrice extracellulaire. Il est surtout
`
`present dans
`
`les
`
`tissus conjonctifs dits
`
`<< mous >> par opposition a d’autres
`
`glycosaminoglycanes comme l’acide chondro'itine sulfurique presents dans les tissus
`
`10
`
`dits << durs >> tels que le cartilage. On le retrouve ainsi en quantites importantes
`
`principalement dans la peau.
`
`Le HA est un glycosaminoglycane lineaire non sulfate compose d’unites
`
`repetitives de D-acide glucuronique et de N—acetyl-D-glucosamine (Tammi R., Agren
`
`UM., Tuhkanen AL., Tammi M. Hyaluronan metabolism in skin. Progress in
`
`15
`
`Histochemz'stry & Cytochemz'stry. 29(2):l-81, 1994).
`
`Dans
`
`la peau normale,
`
`le HA est
`
`synthetise essentiellement par
`
`les
`
`fibroblastes dermiques et
`
`les keratinocytes epidermiques (Tammi R., deja cite).
`
`Grace a ses residus portant une charge negative, le HA joue le role d’une pompe a
`
`eau permettant de maintenir l’elasticite de la peau. Le HA a un role principal dans le
`
`controle de la diffusion des aliments, des hormones, des Vitamines et des sels
`
`inorganiques du tissu conjonctif et dans le nettoyage des dechets metaboliques
`
`pouvant induire des reactions inflammatoires. Avec l’age, la quantite de HA et son
`
`degre de polymerisation diminuent, resultant en une diminution de la quantite d’eau
`
`retenue dans le tissu conjonctif La peau subit alors un processus de Vieillissement
`
`qui aboutit a une augmentation de la fibrose et a une baisse de la teneur en fibres
`
`elastiques. Dans la peau humaine normale, le HA existe sous forme d'un polymere de
`
`haut poids moleculaire (600 000 - l 000 000 Da). La degradation physiologique du
`
`HA dans la peau se fait par (i) l’intemalisation par les keratinocytes et (ii) la
`
`fragmentation intracellulaire
`
`en
`
`fragments
`
`de
`
`taille
`
`intermediaire par
`
`les
`
`hyaluronidases (60 000-300 000 Da). Le HA fragmente est
`
`relache par
`
`les
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`WO 2008/068297
`
`PCT/EP2007/063384
`
`keratinocytes, passe la membrane basale et est libere directement dans les vaisseauX
`
`lymphatiques (Tammi R. et al., deja cite).
`
`Le role de l’acide hyaluronique (HA) en dermatologie est connu dans de
`
`nombreuX domaines dont celui de la cicatrisation, et de l’hydratation. L’acide
`
`hyaluronique agit le plus souvent par ses interactions avec des proteines de liaison et
`
`surtout avec son recepteur transmembranaire CD44 (Tool B.P. 2001, Sem. Cell.
`
`Devel. Biol. 12 : 79-87 , Liao Y-H., Stuart A.J., Drug Delivery, 12 : 327-342, 2005).
`
`L’activation de ce recepteur se traduit par un role de morphogenese, dans la
`
`multiplication et la proliferation cellulaire, l’angiogenese et la migration cellulaire
`
`(G.Weindl, M.Schaller, Skin Pharm. Physiol. 2004 ; l7 ; 207-213). Les donnees de la
`
`litterature suggerent que ces differentes actions seraient fonction de l’environnement
`
`de la cellule, du poids moleculaire de l’acide hyaluronique et de sa concentration. Par
`
`exemple les hauts poids moleculaires inhiberaient
`
`l’angiogenese, alors que les
`
`oligosaccharides la stimuleraient.
`
`La demande de brevet j aponaise JP-l 1279042 met en evidence en topique une
`
`action de fragments d’acide hyaluronique (HAF) sulfates (de masse moleculaire
`
`comprise entre 1 et 50 kDa) qui permettraient de maintenir l’elasticite de la peau et
`
`d’eviter la keratinisation.
`
`Une etude recente realisee sur des fragments de HA (de masse moleculaire
`
`entre 50 et 750 kDa) en topique, met en evidence une relance de la synthese de
`
`l’acide hyaluronique par les keratinocytes (demandes de brevets FR 2 865 651,
`
`WO 2005/082327). Cette activite proliferatrice serait induite par des HAF de poids
`
`moleculaires precis, activite qui n’apparaitrait pas sur des poids moléculaires
`
`superieurs ou inferieurs.
`
`Dans le domaine de l’esthetique, de nombreux produits-injectables a base
`
`d’acide hyaluronique existent. En mesotherapie, des solutions de vitamines, d’anti—
`
`oxydant, de sels mineraux ou d’acide hyaluronique sont utilisees. Les vitamines sont
`
`presentes pour stimuler et entretenir le metabolisme cellulaire, et ainsi relancer la
`
`production de collagene, les anti-oxydants luttent contre le vieillissement, les sels
`
`mineraux seraient indispensables aux activites enzymatiques cellulaires. Quant a
`
`l’acide hyaluronique, il permet de maintenir le volume et l’hydratation de la peau, et
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`WO 2008/068297
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`PCT/EP2007/063384
`
`de creer un ecran protecteur
`
`face aux degradations par
`
`les
`
`radicaux libres
`
`(H.Trommer, S.Wartewig,
`
`Int. Joum. Of Pharm. 254(2003) 223-234). A des
`
`concentrations suffisantes, l’acide hyaluronique creerait un enVironnement optimal
`
`pour la proliferation cellulaire, la neo-synthese de collagene.
`
`Le stress oxydatif generateur de radicaux libres au niveau du derme et de
`
`l’epiderme est responsable du Vieillissement cutane et de l’apparition des rides,
`
`ridules et de l’affaissement des tissus.
`
`En outre,
`
`il a aussi ete demontre que les radicaux libres sont aussi
`
`responsables de la depolymerisation de l’acide hyaluronique in sita, ce qui contribue
`
`d’autant plus au relachement des tissus et du Vieillissement premature de ceux-ci
`
`(Mendoza G., et al, Carbohydrate Research 342, 2007, 96-102).
`
`La matrice extra cellulaire (MEC) est une structure dynamique ayant un role
`
`structurel et regulateur pour les tissus. La MEC est constituee de fibres de collagene
`
`et d’elastine et aussi de substance fondamentale (principalement eau, sels mineraux
`
`et proteoglycanes). Cette matrice confere a la peau sa turgescence et ses proprietes
`
`mecaniques de fermete, elasticite et tonicite.
`
`Les macromolecules de collagene sont des proteines fibreuses formees de
`
`trois chaines polypeptidiques reliees par des liaisons covalentes et hydrogenes. On
`
`denombre 19 type de collagenes dont
`
`la moitie dans la peau. La majorite des
`
`collagenes dermiques appartiennent aux collagenes fibrillaires de type I, III et V.
`
`Chez le jeune adulte, la composition du derme est de 80 % de collagene de
`
`type I et 20% de collagene de type III ; cependant ce rapport se modifie avec l’age
`
`suite aux phenomenes de Vieillissement.
`
`Les elastines sont des proteines organisees en fibres au sein du derme et
`
`apportent a la peau ses proprietes d’elasticite et de souplesse. Ces elastines sont
`
`riches en acides amines a caractere hydrophobe.
`
`La degradation de la MEC intervient au cours de certains processus
`
`physiologiques
`
`tels que la cicatrisation,
`
`le developpement embryonnaire ou
`
`l’angiogenese mais aussi lors de situations pathologiques telles que arthrite, arthrose
`
`ou atherosclerose voire lors des etapes de progression tumorale avec la formation de
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`WO 2008/068297
`
`PCT/EP2007/063384
`
`metastases (Fisher et al, 1997. N. England J. Med.
`
`, 337, 1419-28 ; Shapiro, 1998.
`
`Current Oponions in Cell Biology, 10, 602-608).
`
`Les composants de la MEC sont principalement degrades par des enzymes de
`
`type endopeptidases appelees metalloproteinases matriciellesou MMPs. Ces MMPs
`
`participent activement au processus de cicatrisation mais contribuent aussi au
`
`relachement cutane et a l’apparition des rides qui sont
`
`les premiers signes du
`
`Vieillissement cutane. La famille des MMPs comprend enViron 22 enzymes qui se
`
`distinguent par la specificite Vis a Vis du substrat qu’elles degradent.
`
`La MMP-l, ou collagenase interstitielle, degrade la triple hélice des
`
`collagenes fibrillaires de type III majoritairement mais aussi les collagenes I, 11, VII,
`
`VIII et X.
`
`La MMP-3 degrade quant a elle les glycoproteines telles que la fibronectine
`
`et la laminine, certains proteoglycanes, l’elastine, la gelatine et les collagenes IV et
`
`V. Ces deuX MMPs sont exprimees a la fois par les keratinocytes et les fibroblastes.
`
`Dans le domaine du comblement des rides, des gels de HA reticule
`
`chimiquement sont injectes en intradermique pour combler la depression creusee par
`
`la ride. La reticulation permet d’augmenter la remanence du produit a l’interieur du
`
`derme. Ainsi, si le produit est injecte correctement et selon le profil genetique de
`
`chacun,
`
`le produit permet un comblement en 4 a 6 voir 8 mois. Il est ensuite
`
`10
`
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`
`2O
`
`totalement resorbe dans le derme.
`
`De tels gels a base de HA ou HA reticule permettent une reduction de la ride
`
`par un effet mecanique de comblement de la depression cutanee resultant de cette
`
`ride. Ces produits ne sont effectivement dotes que de cet effet mecanique et ne
`
`contribuent nullement a un quelconque traitement tant preventif que curatif Vis a Vis
`
`du Vieillissement cutane et de la degradation de la MEC, essentielle au maintien des
`
`proprietes mecaniques de la peau telle son elasticite et sa fermete. De tels implants,
`
`s’ils permettent un effacement des rides ou ridules, procurent un effet limite dans le
`
`temps et ne masquent que partiellement les effets du Vieillissement intrinseque de la
`
`peau au niveau de ses structures de maintien representees par la MEC.
`
`Jusqu’a aujourd’hui, plusieurs produits ont ete utilises dans cette meme
`
`application. Les gels ou huiles de silicones sont faciles a mettre en oeuvre, mais
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`

`WO 2008/068297
`
`PCT/EP2007/063384
`
`presentent
`
`l’inconvenient de migrer dans les tissus situes juste sous les points
`
`d’injection. Des phenomenes d’inflammation chroniques ou de reactions allergiques
`
`sont ainsi apparus. De plus la silicone n’est pas biodegradable, et se retrouve dans
`
`certains organes tels que le foie. Differentes suspensions de particules polymeriques
`
`ont aussi ete proposees, mais la plupart ont provoque des reactions de rejets, des
`
`infections, ou des inflammations. Enfin des suspensions de collagene ont ete mises
`
`en oeuvre au cours des demieres annees. Toutefois le collagene est resorbe
`
`relativement rapidement
`
`(entre 1 et 3 mois), et provoque certaines reactions
`
`allergiques dues a sa provenance, generalement d’origine bovine ou porcine.
`
`Il subsiste donc le besoin de disposer d’implants injectables capables de
`
`realiser une action de comblement de la ride mais aussi de revitaliser le derme et
`
`l’epiderme et de contribuer a limiter
`
`les processus de senescence cellulaire
`
`accompagnant le vieillissement cutane tout en ne presentant pas les inconvenients
`
`evoques ci-dessus, ou de maniere beaucoup moins prononcee, le tout accompagne
`
`d’une simplicite et d’un confort accru dans la mise en oeuvre.
`
`La presente invention concerne donc un implant injectable par voie sous-
`
`cutanee ou intradermique sous la forme d'un hydrogel monophasique, caracterise en
`
`ce qu'il comprend en poids de 0,5% a 5%, de preference 0,5% a 4%, plus
`
`preferentiellement 2% d'acide hyaluronique, et dans lequel :
`
`- 50% a 95%, de preference 60% a 90%, plus preferentiellement encore 85%
`
`en poids de l'acide hyaluronique est sous forme de gel reticule ;
`
`- 5% a 50%, de preference 10% a 30 %, plus preferentiellement encore 15% en
`
`poids de l'acide hyaluronique est sous forme libre, ou sous la forme d'un de
`
`ses sels physiologiquement acceptables, d'une masse moleculaire comprise
`
`entre 500 et 2800 kDa, de preference entre 750 et 2600 kDa, plus
`
`preferentiellement entre 800 et 2500 kDa, plus preferentiellement encore
`
`entre 1000 et l500 kDa,
`
`dans un fluide vecteur physiologiquement acceptable, le rapport entre le poids du gel
`
`d'acide hyaluronique reticule et le poids de l'acide hyaluronique libre etant compris
`
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`
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`
`entre l:l et l:0,05.
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`WO 2008/068297
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`PCT/EP2007/063384
`
`Dans une forme particuliere de l’invention,
`
`l’implant pourra comprendre
`
`environ 80% d’acide hyaluronique reticule et environ 20% d’acide hyaluronique
`
`libre, ceci principalement dans le cadre d’une application de l’implant selon
`
`l’invention au traitement des rides fines. Dans le cas du traitement des rides
`
`profondes, la quantite d’acide hyaluronique reticule sera preferentiellement d’environ
`
`85% et la quantite d’acide hyaluronique libre d’environ 15%.
`
`Dans le cadre de la presente invention, par acide hyaluronique ou HA on
`
`entend un glycosaminoglycane lineaire non sulfate compose d’unites repetitives
`
`d'acide D-glucuronique et de N—acetyl-D-glucosamine.
`
`On designe par hydrogel monophasique un hydrogel sous la forme d'une
`
`seule phase homogene.
`
`On designe par sel d'acide hyaluronique physiologiquement acceptable
`
`notamment
`
`les
`
`sels de sodium et de potassium ainsi que leurs melanges.
`
`Avantageusement, le sel est le sel de sodium.
`
`Avantageusement,
`
`le gel constitue d'acide hyaluronique reticule selon
`
`l'invention
`
`a
`
`une
`
`viscosite
`
`comprise
`
`entre
`
`200
`
`et
`
`2000
`
`Pa.s,
`
`plus
`
`particulieremententre 500 et 1800 Pa.s, plus particulierement encore entre 1000 et
`
`1800 Pa.s.
`
`Dans le cas d’un implant destine au traitement des rides profondes, c’est a
`
`dire comprenant 85% d’acide hyaluronique reticule, la viscosite de celui-ci s’etablit
`
`aux environs de 1000 a 1500 Pa.s, particulierement environ 1200 Pa.s. Pour ce qui
`
`est d’un implant principalement destine au rides legeres, donc moins charge en acide
`
`hyaluronique reticule, c’est a dire environ 80% d’acide hyaluronique reticule,
`
`la
`
`viscosite d’un tel
`
`implant s’etablit aux alentours de 200 a 500 Pa.s, plus
`
`10
`
`15
`
`2O
`
`25
`
`particulierement aux environs de 350 Pa.s.
`
`Dans la presente description,
`
`les viscosites indiquees correspondent a des
`
`valeurs mesurees pour un taux de cisaillement de 0,01 s'l.
`
`Avantageusement,
`
`l'acide hyaluronique reticule constituant
`
`le gel selon
`
`l'invention a une masse moleculaire comprise entre 1000 et 6000 kDa, plus
`
`30
`
`avantageusement comprise entre 1000 et 4000 kDa.
`
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`WO 2008/068297
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`PCT/EP2007/063384
`
`Selon un aspect avantageux de l’invention, l’implant injectable contient en
`
`outre du sulfate de chondro'itine.
`
`Avantageusement, la quantite de sulfate de chondro'itine represente en poids
`
`entre 0,05% et 5% du poids total.
`
`Avantageusement,
`
`le sulfate de chondro'itine a une masse moleculaire
`
`comprise entre 2 et 80 kDa, plus avantageusement entre 20 et 50 kDa.
`
`L'implant selon l'invention peut contenir divers additifs habituels. On citera a
`
`titre d'exemple les colorants,
`
`les pigments colorants,
`
`les huiles vegetales,
`
`les
`
`epaississants, les modificateurs de pH, les ajusteurs de l'osmolarite.
`
`L'acide hyaluronique libre, ou l'un de ses sels physiologiquement acceptables,
`
`est avantageusement
`
`reparti de facon homogene a l’interieur du gel d'acide
`
`hyaluronique reticule.
`
`Le
`
`fluide vecteur est avantageusement un tampon isotonique
`
`sterile
`
`apyrogene.
`
`L'implant injectable selon l'invention contient en outre avantageusement au
`
`moins un autre principe actif utilise en dermo-cosmetique.
`
`Avantageusement,
`
`le principe actif dermo-cosmetique est choisi parmi les
`
`vitamines,
`
`les anti-oxydants,
`
`les sels mineraux,
`
`les antiseptiques et
`
`le sulfate de
`
`chondro'itine.
`
`Dans un aspect particulier de l’invention,
`
`l’implant injectable contient du
`
`mannitol qui exerce un effet anti-oxydant au niveau du derme et contribue a
`
`preserver le HA d’une depolymerisation induite par les radicaux libres generes au
`
`sein du derme par le stress oxydatif En effet l’association du mannitol avec le HA a
`
`ete decrite comme ameliorant la protection contre les dommages induits par les
`
`radicaux libres (Belda et al, 2005, J. Cataract Refract. Surg., 31 : 1213-1218). C’est
`
`ainsi un aspect de la presente invention que de foumir un implant injectable tel que
`
`defini ci-dessus et contenant un mannitol en tant qu’anti-oxydant.
`
`Un autre aspect de la presente invention reside dans l’utilisation du mannitol
`
`au sein d’un implant injectable selon la presente invention afin de proteger le derme
`
`des radicaux libres et/ou de limiter la depolymerisation de l’acide hyaluronique
`
`contenu.
`
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`WO 2008/068297
`
`PCT/EP2007/063384
`
`L’invention a done egalement pour objet l’utilisation d’acide hyaluronique
`
`sous forme libre, ou sous la forme d'un de ses sels physiologiquement acceptables,
`
`d'une masse moleculaire comprise entre 500 et 2800 kDa, de preference entre 750 et
`
`2600 kDa, plus preferentiellement entre 800 et 2500 kDa, en presence d’un anti-
`
`oxydant, tel que le mannitol, plus preferentiellement encore entre 1000 et 1500 kDa
`
`pour la fabrication d’un implant destine a proteger le derme des radicauX libres et/ou
`
`a limiter la depolymerisation de l’acide hyaluronique du derme et/ou a prevenir le
`
`vieillissement cutane.
`
`L'implant selon la presente invention est injecte dans le derme superficiel,
`
`10
`
`moyen ou profond.
`
`Il presente l’avantage de pouvoir, des l’injection, provoquer une relance
`
`fibroblastique en favorisant la proliferation cellulaire et la neo-synthese de collagene.
`
`L’activation des fibroblastes genere alors une modulation des mecanismes impliques
`
`dans le remodelage de la matrice extracellulaire, ce qui
`
`se traduit par une
`
`15
`
`revitalisation du derme.
`
`L’implant selon la presente invention presente le double avantage d’obtenir
`
`un effet direct et immediat de reduction de la ride par comblement mecanique de la
`
`depression cutanee et un effet indirect sur un plus long terme de regeneration
`
`cellulaire via une stimulation de la synthese de collagene et une regulation des
`
`2O
`
`MMPs.
`
`L’acide hyaluronique reticule contribue directement a l’effet mecanique de
`
`comblement et permet de par sa nature reticulee d’obtenir un tel effet de maniere
`
`durable sur des periodes plus longues que le HA non reticule.
`
`En outre,
`
`le HA libre contenu dans l’implant selon l’invention inhibe la
`
`surexpression des MMP-l ainsi que la surexpression du collagene 111. De part cette
`
`action regulatrice sur les MMP-l, il contribue a la limitation de la destructuration et
`
`de la destruction de la MEC, structure essentielle au maintien des proprietes
`
`mecaniques de fermete et d’elasticite de la peau.
`
`11 a ete demontre par ailleurs que le ratio collagene III/collagene I augmentait
`
`au cours du vieillissement cutane (Weber et al, 1984, J. Invest. Dermatol, 82, 156-
`
`60). Sachant que dans le cadre de la presente invention,
`
`il a ete constate que la
`
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`
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`
`fraction de HA libre telle qu’utilisee dans l’implant selon l’invention inhibe
`
`l’expression du collagene de type III sans affecter celle du collagene de type I, on
`
`peut raisonnablement penser que l’implant selon l’invention est susceptible de
`
`retablir le ratio collagene III/collagene I tel que mesure au sein de tissus j eunes.
`
`C’est ainsi un objet de la presente invention que d’utiliser un implant selon la
`
`presente invention pour la fabrication d’un medicament destine a maintenir et/ou
`
`retablir le ratio collagene III/collagene I tel que mesure dans les tissus j eunes.
`
`L’association du HA libre de masse moleculaire comprise entre 500 et
`
`2800 kDa avec le gel de HA reticule a pour consequence l’hydratation et le maintien
`
`du volume de la peau, de facon immediate. De plus elle induit une relance
`
`fibroblastique du derme, principalement due a la presence du HA libre, et cette
`
`relance fibroblastique est prolongee dans le temps au fur et a mesure de la
`
`degradation in vivo du gel de HA reticule.
`
`L’implant selon la presente invention peut se representer comme un maillage
`
`tridimensionnel constitue par le HA reticule comprenant en son sein des molecules
`
`de HA libres susceptibles d’induire une stimulation des f1broblastes, d’inhiber la
`
`degradation de la MEC par inhibition des MMPs et de reguler la synthese de
`
`collagene en orientant celle-ci vers un etat correspondant a celui observe dans les
`
`tissus jeunes.
`
`Ces molecules de HA libres sont liberees progressivement a partir de cette
`
`matrice tridimensionnelle de HA reticule tant par diffusion passive que via la
`
`degradation temporelle de la matrice de HA reticule au cours des semaines et mois
`
`suivant l’injection. Ce relargage progressif permet cette action de rejuvenation, de
`
`stimulation cellulaire in situ via ces molecules de HA libres qui sont preservees de la
`
`degradation biologique au sein de ladite matrice tout au long des semaines et peuvent
`
`ainsi exercer leur action sur une periode plus longue que si elles etaient injectees
`
`seules.
`
`C’est ainsi un objet de la presente invention que l’utilisation d’acide
`
`hyaluronique sous forme libre, ou sous la forme d'un de ses sels physiologiquement
`
`acceptables, d'une masse moleculaire comprise entre 500 et 2800 kDa, de preference
`
`entre 750 et 2600 kDa, plus preferentiellement entre 800 et 2500 kDa, plus
`
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`
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`
`preferentiellement encore entre 1000 et 1500 kDa, reparti au sein d’un gel d’acide
`
`hyaluronique reticule, pour la fabrication d’un implant sous cutane destiné au
`
`comblement des rides et a la relance cellulaire epidermique et/ou au maintien des
`
`proprietes mecaniques de fermete et d’elasticite de la peau.
`
`Donc l'implant selon l'invention combine l'effet mecanique du gel réticulé,
`
`qui gonfle et remodele la ride, avec l'action bio lo gique du HA libre.
`
`L'invention a egalement pour objet un kit se presentant sous la forme de
`
`seringue contenant un implant injectable tel que decrit précédemment.
`
`L'invention a encore pour obj et l'implant tel que decrit precedemment en tant
`
`10
`
`que medicament.
`
`L'invention conceme egalement l'utilisation d'un implant injectable tel que
`
`precedemment decrit pour le comblement des rides, ridules, depressions cutanees
`
`et/ou cicatrices comprenant l'injection sous-cutanee d'un tel implant.
`
`L'implant injectable selon l’invention peut etre utilise pour la preparation
`
`d’un medicament destine a stimuler le metabolisme epidermique et dermique et/ou a
`
`relancer l’actiVite cellulaire epidermique.
`
`L'implant injectable selon l’invention peut etre utilise pour la preparation
`
`d’un medicament destine a stimuler l'actiVite anti-oxydante du derme et/ou a prevenir
`
`le Vieillissement cutane.
`
`L'invention conceme egalement un procede cosmetique de comblement des
`
`rides et/ou ridules, comprenant l’injection d’au moins un implant injectable selon
`
`l'invention.
`
`L'invention a egalement pour objet un procede de preparation d’un implant
`
`injectable tel que décrit precedemment. Il peut etre prepare par toute technique
`
`connue de l'homme du metier, par exemple par un diepoxy, notamment le butanediol
`
`diglycidyle ether (BDDE) ou le l,2,7,8-diepoxy-octane. Avec une reticulation en
`
`milieu basique, la concentration en diepoxy peut varier par exemple entre 5 et 15%
`
`par rapport a l'acide hyaluronique pour une reticulation en bain-marie a 45-550C
`
`pendant 1,5 a 6 h. Le gel reticule est ensuite purifie par les techniques classiques de
`
`l'homme de l'art: differents bains d'eau desionisee, precipitation alcoolique, dialyse. ..
`
`pour eliminer les traces de reticulant residuel. A ce gel purifie, du HA de poids
`
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`ll
`
`moleculaire adequat, prealablenient hydrate dans un tampon adequat, sera ajoute. Le
`
`produit fini sera enfin degaze, niis en seringue ou tout autre recipient adequat et
`
`sterilise par autoclavage.
`
`Un procede avantageux selon l'invention comprend les etapes suivantes:
`
`5
`
`1) preparation d'un gel reticule selon les etapes suivantes :
`
`-
`
`introduction d’acide hyaluronique dans un fluide basique,
`
`- gonflement, homogeneisation sous agitation lente et reticulation a
`
`chaud,
`
`- neutralisation et gonflement du gel
`
`reticule dans une
`
`solution
`
`1 O
`
`tamponnee a pH d’enViron 7 additionnee d’agent isoosniolarisant,
`
`-
`
`elimination du reticulant,
`
`2) preparation d'un gel d’acide hyaluronique libre par :
`
`-
`
`introduction d’acide hyaluronique dans une solution tamponnee aux
`
`environ de pH 7, isoosniolaire ;
`
`15
`
`- gonflenient,
`
`3) melange du gel
`
`reticule obtenu a l'etape
`
`l) avec le gel d’acide
`
`hyaluronique libre obtenu a l'etape 2),
`
`4) degazage optionnel et eventuellenient conditionnenient en flacons ou
`
`seringues puis sterilisation.
`
`2O
`
`Avantageusenient,
`
`le pH du gel apres sterilisation est d’enViron 7 et
`
`l'osniolarite aux enVirons de 250 a 350 mOsm, preferentiellenient entre 300 et
`
`320 mOsm.
`
`L'invention va maintenant etre illustree, de maniere non limitative, par les
`
`2 5
`
`exemples suivants.
`
`Exemple 1 :
`
`Caracterisation de l'actiVite de HA de differentes masses moleculaires sur :
`
`- des fibroblastes sains ;
`
`3 O
`
`- des fibroblastes senescents (par stress oxydatif a H202).
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`
`La MMP-l (ou collagenase l) est une collagenase interstitielle qui degrade la
`
`triple helice des collagenes fibrillaires comme les collagenes I et III. Au niveau
`
`cutane, elle est exprimee et secretee par les fibroblastes et les keratinocytes. La
`
`MMP-l est impliquee dans le Vieillissement. En effet, sa surproduction au cours du
`
`Vieillissement pourrait etre impliquee dans la perte de fermete et d'elasticite, et
`
`l'apparition des rides. Lorsque l'on induit la senescence avec H2O2, on observe chez
`
`les fibroblastes une tres forte augmentation de la MMP-l. Les principes actifs
`
`capables de reduire cette surproductionpourraientdonc avoir des proprietes "anti-
`
`age".
`
`10
`
`Les
`
`fibroblastes
`
`sont obtenus a partir de peau provenant de dechets
`
`operatoires de sujets jeunes. Les echantillons ont ete laVes dans du PBS et de
`
`l'ethanol. Des petits morceaux de peau ont ete coupes et repartis dans des boites de
`
`culture et immerges dans un milieu favorable a la proliferation des fibroblastes
`
`(DMEM + 10% SVF). A ce milieu, de la primocine a ete ajoutee. Celle-ci est
`
`antibiotique, antifongique et antimicoplasme. Les boites de cultures sont mises a
`
`incuber.
`
`Pour induire la senescence, les fibroblastes sont ensemences dans des boites
`
`de cultures. 24 heures apres,
`
`le principe actif a tester est
`
`rajoute selon la
`
`concentration appropriee, dans du DMEM. Apres 24 heures d'incubation, les cellules
`
`sont soumises a un stress oxydant. Elles sont incubees pendant 2 heures a 37°C, dans
`
`une solution d'H2O2 a 75 MM dans du PBS. 11 s'agit d'un stress aigu qui induit la
`
`senescence des cellules. Les fibroblastes sont ensuite replaces dans du DMEM
`
`complete avec 10% de SVF. 72 heures apres la fin du stress, les fibroblastes sont
`
`rentres en senescence.
`
`1.1. Protocole d'incubation.
`
`Pour les fibroblastes senescents :
`
`les HA sont ajoutes a une concentration
`
`finale de l ug/ml, ils sont laisses pendant le stress H2O2, soit 24 h d'incubation.
`
`Pour les fibroblastes sains : les HA sont incubes egalement 24 h a l ug/ml.
`
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`
`1.2. Extraction des ARN totaux a l’aide du kit d’extraction Rneasy (Qiagen) a la fin
`
`de l'experience (J5, c'est a dire 72 h post-stress).
`
`1.3. Dosage des ARN totaux.
`
`Le dosage qualitatif et quantitatif des ARN totaux est realise a l’aide du kit de
`
`dosage RNA 6000 Nano LabChip et de l’appareil Bioanalyseur 2100 (Agilent). Il
`
`repose sur le principe de la migration electrophoretique des echantillons dans une
`
`nanopuce. Le rapport des ARN ribosomaux 288/188 est calcule ; il est informatif
`
`pour evaluer l’integrite des ARN. De plus, la purete des ARN vis a vis de l’ADN
`
`10
`
`genomique est estimee.
`
`1.4. Analyse des taux de transcription par PCR en temps reel.
`
`La PCR en temps
`
`reel permet de quantifier
`
`le niveau d’expression
`
`transcriptionnel d’un gene d’interet par amplification des ADNc, obtenus par
`
`transcription inverse, des ARNm du gene present dans le lysat cellulaire. Le melange
`
`reactionnel est constitue d’ADNc et du melange du couple d’amorces d’interet avec
`
`une solution d’iQ Syerreen Supermix (Biorad) contenant, entre autres,
`
`la Taq
`
`Polymerase et un agent intercalant du petit sillon des doubles helices d’ADN :
`
`le
`
`Sybr Green (agent intercalant fluorescent). La reaction se fait dans le thermocycleur
`
`Icycler
`
`IQ (Biorad) ;
`
`il
`
`s’agit
`
`d’une
`
`suite
`
`de
`
`cycles
`
`de
`
`denaturation/
`
`15
`
`2O
`
`hybridation/elongation.
`
`1.4.1. Transcription inverse : les ARN totaux sont << retro-transcrits >> en ADNc a
`
`l’aide du kit Reverse Transcription System (Promega) et de l’appareil Gene Amp
`
`25
`
`PCR System 2400 (Perkin Elmer).
`
`1.4.2. Mesure du taux de transcription d’un gene d’interet : le niveau d’expression du
`
`gene d’interét est normalise par le niveau d’expression de genes de reference, qui
`
`varient peu avec la senescence. Le niveau d’expression du gene d’interet est calcule
`
`30
`
`selon la formule : 2 (CTmin-CT) ou CT signifie "cycle threshold".
`
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`
`

`

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`
`PCT/EP2007/063384
`
`14
`
`Il est normalise, par rapport a l’expression des trois genes de reference
`
`selectionnes, selon le calcul : 2 (CTniin-CT) / facteur de normalisation.
`
`1.5. Resultats sur l’expression de MMP-l.
`
`Les fibroblastes rendus senescents par incubation avec H2O2 expriniaient 2,14
`
`fois plus la MMP-l que les fibroblastes normaux (donc la senescence a bien ete
`
`induite). En presence de Vitamine E (controle positif), la surexpression de MMP-l
`
`par les fibroblastes senescents etait reduite de 40%.
`
`La surexpression de MMP-l etait reduite de 40% en presence de HA 450 kDa
`
`(10 ug/ml), de 75% en presence de HA 800 kDa (10 ug/ml), de 71% en presence de
`
`HA 1500 kDa (10 ug/ml), de 83% en presence de HA 2600 kDa (10 ug/ml).
`
`1.6. Resultats sur l’expression du collagene de type I et III
`
`Sur
`
`les
`
`fibroblastes rendus senescents par
`
`incubation avec H2O2, une
`
`inhibition variable de la transcription de collagene de type I a ete mesuree ; une telle
`
`inhibition semblait cependant dependante des donneurs. Sur un des don